呂順　周軍杰　謝曉濤　陳賢奇　高文武　劉鋮　張磊

.綜述 Review.

軟骨組織工程種子細(xì)胞獲取培養(yǎng)及鑒定研究進(jìn)展

組織工程；間質(zhì)干細(xì)胞；骨生成；膠原 II 型；種子細(xì)胞

骨關(guān)節(jié)炎是全球范圍內(nèi)最常見的疾病之一，其病變部位產(chǎn)生的疼痛、腫脹、肌肉萎縮等功能障礙嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。關(guān)節(jié)軟骨缺損被公認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的早期病理表現(xiàn)，保護(hù)和修復(fù)缺損的關(guān)節(jié)軟骨成為早期干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的主要措施［1-2］。關(guān)節(jié)軟骨損傷后自我修復(fù)能力有限，傳統(tǒng)外科修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的方法主要包括軟骨下鉆孔、磨削術(shù)和微骨折術(shù)等手段，但這種“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的治療模式臨床效果并不理想［3］。近年來運(yùn)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損成為干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎研究的熱點(diǎn)。軟骨組織工程主要包括種子細(xì)胞、支架材料和培養(yǎng)環(huán)境三大要素［4-5］，種子細(xì)胞的獲得培養(yǎng)及鑒定是整個(gè)組織工程學(xué)的基礎(chǔ)，選擇一種具有多向分化能力、免疫原性低、來源廣的種子細(xì)胞顯得尤為重要?，F(xiàn)就軟骨組織工程種子細(xì)胞的獲取培養(yǎng)及鑒定的研究進(jìn)展綜述如下。

一、軟骨組織工程種子細(xì)胞的獲取來源

1. 關(guān)節(jié)組織中獲取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞：最初研究者采用軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中的細(xì)胞成分，能分泌 II 型膠原和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)［6］。自 1967 年 Manning 等［7］提出通過胰蛋白酶和細(xì)菌膠原酶聯(lián)合消化法分離軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法不斷完善發(fā)展。王朝強(qiáng)等［8］應(yīng)用膠原酶、胰酶制定了 8 種消化方法獲取幼犬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過 MTT 比色法、甲苯胺藍(lán)染色及 II 型膠原免疫組織化學(xué)染色法等手段對所獲得軟骨細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞成活率進(jìn)行檢測分析，得出單純應(yīng)用 II 型膠原酶獲得軟骨細(xì)胞數(shù)量最多，且 5 代以內(nèi)軟骨細(xì)胞保持良好的細(xì)胞形態(tài)及表型。閆虎等［9］在此基礎(chǔ)上采用II 型膠原酶消化并機(jī)械吹打的方法，獲取培養(yǎng) 4 周齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)后 6 h，貼壁生長，培養(yǎng)后 72 h 形成單層，培養(yǎng)后96 h 可傳代培養(yǎng)；MTT 法檢測前 3 代軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定。王林林等［10］、劉小榮等［11］及耿書國等［12］采用相同的方法均可獲得穩(wěn)定增殖的軟骨細(xì)胞，即機(jī)械-酶消化法可建立軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)體系。此種分離獲取軟骨細(xì)胞方法同樣適用人類軟骨細(xì)胞，唐新等［13］和童迅等［14］采用兩步酶消化法 （胰蛋白酶+II 型膠原酶）分別取全膝置換術(shù)患者和創(chuàng)傷性截肢患者膝關(guān)節(jié)軟骨分離培養(yǎng)，通過上述方法檢測得出此種方法可得到純度較高的軟骨細(xì)胞，傳代 4 代以內(nèi)人類軟骨細(xì)胞表型及生物學(xué)特性穩(wěn)定，可用于實(shí)驗(yàn)研究。直接在軟骨組織中獲取軟骨細(xì)胞方法雖簡便易行，但其作為種子細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程存在一定缺陷，如來源少、增殖能力有限、體外長時(shí)間培養(yǎng)易發(fā)生去分化現(xiàn)象等。因此從軟骨組織中直接獲取軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞并不理想。

2. 干細(xì)胞的誘導(dǎo)獲取種子細(xì)胞研究：具有無限或較長時(shí)間自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞，克服了成熟軟骨細(xì)胞的缺點(diǎn)。根據(jù)來源和個(gè)體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和誘導(dǎo)性干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓一種成體干細(xì)胞，具有干細(xì)胞共性。由于它具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱等組織分化的潛能，且具有取材方便對機(jī)體無害、取自自體無免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［15］。因此以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）為主的成體干細(xì)胞逐漸被研究者關(guān)注，利用BMSCs 或脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)軟骨缺損成為研究熱點(diǎn)［16］。譚榮邦等［17］采用全骨髓培養(yǎng)+貼壁純化法分離培養(yǎng) BMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定為 BMSCs后，以轉(zhuǎn)化生長因子 β1 （transforming growth factor β1，TGF-β1）、胰島素樣生長因子 1 （insulin-like growth factor 1，IGF-1）作為誘導(dǎo)因子誘導(dǎo) BMSCs 定向分化為軟骨細(xì)胞，II 型膠原免疫化學(xué)染色法鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞呈陽性，光鏡及電鏡下顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞細(xì)胞器豐富，胞核增大，核仁增多。提示誘導(dǎo)后的 BMSCs 具有軟骨細(xì)胞表型，細(xì)胞分化代謝旺盛。畢曉娟等［18］及朱寅等［19］取吸脂術(shù)后脂肪組織分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并鑒定，采用三維培養(yǎng)法和添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，阿利辛藍(lán)染色及蘇木精-伊紅染色進(jìn)行組織學(xué)分析，免疫熒光檢測 II 型膠原表達(dá)，結(jié)果經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)大量糖胺多糖及 II 型膠原，具有軟骨細(xì)胞的特性。劉曉潭等［20］取昆明種雄性小鼠附睪處脂肪，分離獲取脂肪干細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，經(jīng)誘導(dǎo)后行甲苯胺藍(lán)染色，番紅 O 染色，II 型膠原免疫組織化學(xué)檢測呈陽性，證實(shí)從脂肪組織中可分離到具有分化潛能的干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后可分化為軟骨細(xì)胞，具有來源廣泛，取材方便等優(yōu)點(diǎn)，可成為組織工程理想的種子細(xì)胞。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cell，iPSC）是通過體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將已分化的成體細(xì)胞重編程所獲得的一類干細(xì)胞，iPSC 具有 ESC 的全能性［21］。劉康等［22］通過全骨髓貼壁分離法體外分離、擴(kuò)增兔 BMSCs，利用腺病毒載體將生長分化因子 5 （growth and differentiation factor 5，GDF5）基因?qū)?BMSCs，采用番紅-O 染色和甲苯胺藍(lán)染色檢測糖胺聚糖和蛋白聚糖、RT-PCR 和免疫化學(xué)染色檢測軟骨細(xì)胞特異性 Collagen II 和 Aggrecan 基因和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn) GDF5 腺病毒感染的 BMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量顯著增加，軟骨細(xì)胞特異性 Collagen II和 Aggrecan 基因和蛋白表達(dá)升高，表明基因?qū)?GDF5 可促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化。與 ESC 不同，iPSC的獲取人們可以在不損毀胚胎或不用卵母細(xì)胞的前提下制備用于疾病研究或治療的 ESC 樣細(xì)胞。這樣不僅成功地避免了長期以來爭論不休的倫理問題的困擾，也為獲得具有患者自身遺傳背景的 ESC 樣細(xì)胞增加了新途徑。

然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)將 BMSCs 分化獲得的軟骨細(xì)胞移植至裸鼠皮下存在“血管化”、“骨化”等問題［23-24］。而目前發(fā)現(xiàn)，部分組織中的成體干細(xì)胞不僅可以向自身組織進(jìn)行分化，也可以向無關(guān)組織類型的成熟細(xì)胞進(jìn)行分化，這種現(xiàn)象被稱為轉(zhuǎn)分化［25-26］。近來有研究報(bào)道，軟骨組織中存在一群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，可能成為軟骨缺損修復(fù)的理想種子細(xì)胞［27］。薛珂等［28］利用纖維連接蛋白黏附法分別從豬耳軟骨、關(guān)節(jié)軟骨以及椎間盤軟骨中分離培養(yǎng)干細(xì)胞，采用倒置相差顯微鏡及流式細(xì)胞儀技術(shù)對其進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定，并進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂的定向分化誘導(dǎo)，成軟骨誘導(dǎo)后，3 種亞型軟骨組織來源干細(xì)胞 Aggrecan、II 型膠原基因相對表達(dá)量高于 BMSCs （P＜0.05）。提示不同亞型的豬軟骨組織中均存在軟骨干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的典型特征。這種轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制一旦被闡明，就有望利用患者自身健康組織的干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成可替代病變組織功能的細(xì)胞來治療疾病，這樣既克服了由于異體細(xì)胞移植而引起的免疫排斥，又避免了胚胎干細(xì)胞來源不足以及相應(yīng)的社會倫理問題。因此轉(zhuǎn)分化的發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞研究中具有革命性意義，它為干細(xì)胞組織工程在臨床治療中廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3. 干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)：國內(nèi)外研究均已證實(shí)干細(xì)胞在特定生長因子刺激下可向軟骨細(xì)胞定向分化，但此方法需要較多的種子細(xì)胞及昂貴的生長因子。機(jī)體內(nèi)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化是眾多生長因子共同作用的結(jié)果，體外單一生長因子誘導(dǎo)形成的軟骨細(xì)胞難免與體內(nèi)分化形成的軟骨細(xì)胞存在差異。因此，近年來共培養(yǎng)技術(shù)在組織工程研究中運(yùn)用廣泛，且已有相關(guān)研究應(yīng)用動物來源的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子誘導(dǎo)人源干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化［29-30］。鄭朋飛等［31］將人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與兔軟骨細(xì)胞按照 2∶1或 3∶1 的比例共培養(yǎng)，并用 100 μg / L 的胰島素樣生長因子 1 進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后 14 天，運(yùn)用 RT-PCR 檢測聚集蛋白和 II 型膠原 mRNA 的表達(dá)，Western blot 檢測聚集蛋白和 II 型膠原蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)以 3∶1 共培養(yǎng)時(shí) II 型膠原蛋白及聚集蛋白多糖蛋白表達(dá)更明顯，得出人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與兔軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，且按 3∶1 的比例共培養(yǎng)可獲得更多的軟骨細(xì)胞。張瑾等［32］將微囊化的第 2 代兔軟骨細(xì)胞與第3 代兔 BMSCs 按 1∶1 比例在 Transwell 小室進(jìn)行共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，將干細(xì)胞與第 2 代兔軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)于Transwell 小室作為對照組，以及干細(xì)胞培養(yǎng)組作為空白組，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)對照組增值率低于實(shí)驗(yàn)組和空白組 （P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組較其它兩組糖胺聚糖和 II 型膠原蛋白水平均高 （P＜0.05），表明微囊化軟骨細(xì)胞與 BMSCs 共培養(yǎng)，可成功誘導(dǎo) BMSCs 定向分化，誘導(dǎo)效果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。共培養(yǎng)技術(shù)能夠使軟骨細(xì)胞快速增殖，從而減少軟骨細(xì)胞的用量，避免了為獲取足夠量的軟骨細(xì)胞反復(fù)傳代培養(yǎng)而引起的軟骨細(xì)胞老化和去分化，因此 BMSCs 和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)對優(yōu)化和擴(kuò)大種子細(xì)胞源可能是一種實(shí)用的策略。

二、軟骨組織工程中種子細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

1. 軟骨組織工程中種子細(xì)胞的培養(yǎng)方法：組織工程種子細(xì)胞的培養(yǎng)除了必要的培養(yǎng)基質(zhì)及生長因子外，同時(shí)必須與支架材料具有良好的相容性［33-34］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)人臍帶 Wharton 膠富含透明質(zhì)酸、糖胺多糖及膠原等，還包含很多生長因子諸如胰島素生長因子和其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。高鉞等［35］用差速離心法制作人臍帶 Wharton 膠細(xì)胞外基質(zhì) （hWJECM），制成 0.5% 濃度鋪于培養(yǎng)板中形成 1 mm厚的薄膜作為實(shí)驗(yàn)組，單純培養(yǎng)液組作為空白對照組，經(jīng)倒置顯微鏡觀察、甲苯胺藍(lán)染色及 CCK 檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組增殖情況優(yōu)于對照組，證實(shí) hWJECM 免疫原性低，無細(xì)胞毒性作用，適宜軟骨細(xì)胞培養(yǎng)。詹興旺等［36］采用冷凍干燥法將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 膠原與 3% 殼聚糖混合制備膠原-殼聚糖多孔支架，并將第 2 代兔軟骨細(xì)胞接種到支架上，培養(yǎng)后 2 周檢測細(xì)胞增殖率、蛋白聚糖及 II 型膠原 mRNA 表達(dá)均優(yōu)于對照組，得出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 膠原與3% 殼聚糖的混合支架適合軟骨細(xì)胞生長增殖，可作為一種良好的修復(fù)和重建軟骨載體。同時(shí)還有其它的技術(shù)應(yīng)用于軟骨組織工程中軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)，如為載體技術(shù)［37］、微重力條件［38］及細(xì)胞衍生的細(xì)胞外基質(zhì)支架等技術(shù)［39］。隨著科學(xué)工學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，3 D 打印技術(shù)不斷應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域［40］。國內(nèi)外已有研究將 3 D 打印技術(shù)應(yīng)用于軟骨組織工程中，通過 3 D 打印技術(shù)制作具有特定形態(tài)的骨軟骨一體化支架，接種種子細(xì)胞并培養(yǎng)成為具有特定形態(tài)的骨軟骨一體化再生支架組織，用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究［41-42］。

2. 軟骨細(xì)胞的鑒定：

（1）倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)：倒置顯微鏡觀察原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，細(xì)胞懸浮后 24 h 大部分可貼壁。貼壁后細(xì)胞形態(tài)呈梭形或三角形或多角形，胞漿內(nèi)可見折光的顆粒，周圍有細(xì)長的突起，核明顯呈圓形或橢圓形，核仁清晰。細(xì)胞懸浮后 1 周即可長滿瓶壁，鏡下觀察可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。隨著傳代次數(shù)的增加，梭形細(xì)胞增多，分泌和增殖能力下降，傳代周期延長［43-44］。

（2）軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物鑒定：軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中的細(xì)胞成分，軟骨基質(zhì)中主要包括無定型基質(zhì)和包埋于基質(zhì)中的膠原纖維構(gòu)成。無定型基質(zhì)中主要為 3 種糖胺聚糖分子結(jié)合于核心蛋白形成大分子聚集蛋白聚糖，關(guān)節(jié)軟骨中的纖維主要是由 II 型膠原蛋白組成的膠原原纖維，含量約為軟骨基質(zhì)的 40%。

a. 甲苯胺藍(lán)染色：甲苯胺藍(lán)染色可作為軟骨細(xì)胞的特異性染色，其原理是軟骨細(xì)胞分泌的蛋白聚糖經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色顯色為異染的藍(lán)紫色。正常原代軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)紫色異染顆粒，并且有少量的異染顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞周圍，集落樣生長區(qū)域和多層生長區(qū)域的軟骨細(xì)胞這一表現(xiàn)尤為明顯，異染顆粒呈紫紅色可以出現(xiàn)在部分細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)中，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色正染呈淺藍(lán)色［45］。

b. II 型膠原免疫組化染色：II 型膠原被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞最特異的表面標(biāo)記之一，是軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中特異性蛋白?？赏ㄟ^ II 型膠原免疫組化染色特異性鑒定軟骨細(xì)胞，陽性反應(yīng)是軟骨細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色，胞核不著色。細(xì)胞經(jīng)傳代后，棕黃色著色漸減弱［46］。

總之，利用軟骨組織工程手段修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損為臨床干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎提供新的思路和方法，種子細(xì)胞的老化和缺乏是限制軟骨組織工程加速發(fā)展的瓶頸的問題。筆者通過綜述軟骨組織工程種子細(xì)胞獲取來源及鑒別，希望為今后開發(fā)和挖掘更多的種子細(xì)胞源提供理論基礎(chǔ)。通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前軟骨組織工程種子細(xì)胞獲取來源主要來自于自體軟骨細(xì)胞、各種來源的成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)性干細(xì)胞以及共培養(yǎng)獲得的軟骨細(xì)胞。隨著研究的不斷深入已基本解決前期所面臨的問題，如種子細(xì)胞數(shù)量少、免疫問題及細(xì)胞表型不穩(wěn)定等。但還有較多問題需要解決，如：安全性問題、效率問題及遠(yuǎn)期效果的問題。相信通過對種子細(xì)胞的進(jìn)一步純化以及培養(yǎng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化，一些新技術(shù)手段應(yīng)用如共培養(yǎng)技術(shù)、3 D 打印技術(shù)應(yīng)用于軟骨組織工程中，一定可以培養(yǎng)出可移植于體內(nèi)的具有特定形態(tài)骨軟骨一體化再生組織，用于解決關(guān)節(jié)軟骨損傷這一醫(yī)學(xué)難題。

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（本文編輯：李貴存）

Research of obtaining and identification of seed cells in cartilage tissue engineering

ZHOU Jun-jie， Email： boysroger@126.com

ObjectiveTo review the sources， cultivation and identifcation of seed cells in cartilage tissue engineering. MethodsRelated basic research literature on obtaining seed cells in cartilage tissue engineering was reviewed and analyzed， while repeated research was removed. ResultsChondrocytes could be induced and differentiated from animal carticular chodrocytes， mesenchymal stem cells （MSCs）， induced pluripotent stem cells（iPSCs）and cartilage stem mesenchymal stem cells， which were proved to have typical chondrocyte characteristic and good biological characteristics. ConclusionsThese discoveries are lack of in-depth understanding on the exact mechanism that inducing factors induce differentiation of seed cells into chondrocytes. It remains to be articulated how the mechanism operates on inducing differentiation between cells and how to culture regenerated cartilage with characteristic morphology through 3-D printing and cartilage tissue engineering integration. Exploration of the underlying mechanisms will facilitate scientifc progress for the clinical treatment of osteoarthritis and other related diseases.

Tissue engineering；Mesenchymal stem cells；Osteogenesis；Collagen type II；Seed cells

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.008

Q813

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 （NO.2013QK20）；上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生“創(chuàng)新能力培養(yǎng)”專項(xiàng)科研項(xiàng)目 （NO.2015YCX14）

200062 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院骨科

周軍杰，Email： boysroger@126.com

2015-09-10）