管翠萍　石晶　周學(xué)章

摘要：G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）參與調(diào)節(jié)人體各種生理過(guò)程，它的突變及基因多態(tài)性與多種人類(lèi)遺傳性疾病相關(guān)，其中50%以上的疾病突變是由功能性單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的。因此，建立基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性研究成為主要熱點(diǎn)之一。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，各種機(jī)器學(xué)習(xí)方法、特征提取和數(shù)據(jù)庫(kù)資源的綜合利用，極大地方便了GPCR的突變研究。介紹了GPCR上以功能性單核苷酸多態(tài)性突變?yōu)橹鞯纳镄畔W(xué)研究方法和數(shù)據(jù)資源。

關(guān)鍵詞：G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）；突變；功能性單核苷酸多態(tài)性；生物信息

中圖分類(lèi)號(hào)：Q51；Q-332 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5342-04

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是人體內(nèi)最大的膜受體蛋白家族，參與調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程，在信號(hào)識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，同時(shí)它也是藥物開(kāi)發(fā)史上最有價(jià)值的藥物靶標(biāo)。GPCR的突變及其基因多態(tài)性將會(huì)引起功能失調(diào)導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生， 例如視紫紅質(zhì)受體突變會(huì)引發(fā)夜盲癥和色素性視網(wǎng)膜炎[1]；鈣敏感受體突變會(huì)引發(fā)遺傳性鈣代謝紊亂，導(dǎo)致家族性低鈣血癥和低鈣尿高血鈣癥的產(chǎn)生[2]；GPR56受體N末端突變會(huì)導(dǎo)致大腦皮質(zhì)畸形（BFPP）[3]等。在GPCRs突變體與疾病的相關(guān)性研究中，值得一提的是，大多數(shù)與疾病相關(guān)的突變只發(fā)生在少數(shù)的幾類(lèi)GPCRs中，例如加壓素類(lèi)受體、鈣敏感受體、視紫紅質(zhì)類(lèi)受體、促黃體生成素受體、促甲狀腺素受體和黑皮素受體MC2和MC4，在這幾類(lèi)受體上包含了大多數(shù)的疾病突變位點(diǎn)[4]。另外，與GPCR相互偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生突變后，同樣會(huì)引起信號(hào)通路異常，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，例如低甲狀旁腺激素癥和青春期早熟等遺傳性疾病都與G蛋白α亞基的突變有關(guān)，β、γ亞基暫無(wú)疾病相關(guān)性報(bào)道。

1 GPCR突變及多態(tài)性研究

1.1 GPCR突變類(lèi)型

編碼GPCR與G蛋白的基因發(fā)生突變后都有可能影響蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致功能的失活或是激活，據(jù)此，相應(yīng)的突變也分為功能失活性突變和功能激活性突變兩種類(lèi)型。GPCR的失活性突變主要包括各種錯(cuò)義、無(wú)義、移碼突變等，它們使得正常的受體蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（截短），阻止了激動(dòng)劑綁定后所應(yīng)發(fā)生的信號(hào)反應(yīng)；與失活性突變不同，大多數(shù)激活性突變都是錯(cuò)義突變，它使得維持受體處于非活化狀態(tài)的正常約束力受到破壞，在沒(méi)有激動(dòng)劑的情況下受體仍然保持著與激動(dòng)劑綁定的狀態(tài)，改變平衡向著受體激活狀態(tài)發(fā)展，最終導(dǎo)致不依賴(lài)于激動(dòng)劑的信號(hào)反應(yīng)的產(chǎn)生[4，5]。與疾病相關(guān)的突變往往發(fā)生在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域或是功能位點(diǎn)上，在GPCR結(jié)構(gòu)中，跨膜螺旋區(qū)控制著受體激活狀態(tài)與非激活狀態(tài)之間的平衡，是相對(duì)保守的區(qū)域，因此突變位點(diǎn)也以跨膜螺旋區(qū)較為常見(jiàn)[6-8]。

1.2 GPCR與功能性單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類(lèi)基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上，其中的非同義單核苷酸多態(tài)性（Non-synonymous SNPs，nsSNPs），也稱(chēng)為錯(cuò)義SNP，會(huì)引起氨基酸序列的改變，有些改變直接影響到了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，從而增加了疾病的易感性[9]。這些nsSNPs往往都與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成中的重要?dú)埢凸δ芪稽c(diǎn)緊密相關(guān)[10，11]，因此也被稱(chēng)為功能性SNP，或者是有害nsSNP。據(jù)報(bào)道，每個(gè)人身上大約存在24 000～40 000個(gè)nsSNPs位點(diǎn)[12]，其中引起人類(lèi)遺傳性疾病的突變中， 50%以上都是由nsSNPs構(gòu)成的[13]。例如，β2-AR腎上腺素基因發(fā)現(xiàn)有17個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中的一些功能性SNPs分別與心臟病、心血管疾病以及哮喘的發(fā)生有關(guān)[14，15]；GPR10受體啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性與肥胖和糖尿病有關(guān)[16]；GPCR40基因多態(tài)性與胰島素分泌和β細(xì)胞功能下降有關(guān)[17，18]。所以，在GPCRs的突變位點(diǎn)研究中，又以具有功能作用的nsSNPs備受藥物設(shè)計(jì)者的關(guān)注。這些SNPs可能是人類(lèi)基因組中疾病易感基因的遺傳標(biāo)記，甚至是直接影響癌癥、心臟病、糖尿病與其他常見(jiàn)病的易感性基因位點(diǎn)。

1.3 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)功能性SNPs

目前，利用生物信息學(xué)方法對(duì)GPCR進(jìn)行的突變分析還是以其中的功能性SNPs預(yù)測(cè)為主，由于已知的GPCRs的三維結(jié)構(gòu)特征有限，所以一些根據(jù)氨基酸變異影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)nsSNP致病性的方法是不適用于GPCRs研究的，因此，各種基于序列的分類(lèi)特征逐漸被應(yīng)用到GPCRs上致病性SNPs的預(yù)測(cè)。Miller等[19]指出，疾病相關(guān)的SNP與中性SNP相比，在保守性、替換類(lèi)型及頻率、化學(xué)性質(zhì)變化等存在顯著差異。Balasubramanian等[6]結(jié)合氨基酸的理化性質(zhì)、進(jìn)化信息和替代矩陣值3個(gè)方面的序列特征，建立logistic回歸模型對(duì)GPCR上的SNPs與疾病潛在的相關(guān)性進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為89%，最后得到了115個(gè)可能與疾病相關(guān)的SNPs位點(diǎn)。Xue等[20]在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考慮了GPCRs序列和結(jié)構(gòu)的特征，并優(yōu)化特征屬性集，確定了6個(gè)特征：保守性、BLoSUM62矩陣值、疏水性變化、突變位置、相對(duì)溶劑可及性和掩埋電荷，利用決策樹(shù)方法對(duì)功能性SNPs進(jìn)行預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確率為91%，并總結(jié)出30條規(guī)則來(lái)區(qū)分功能性突變和非功能性突變。

現(xiàn)已報(bào)道的關(guān)于GPCRs上功能性SNPs的預(yù)測(cè)研究還很有限，而研究比較多的關(guān)于功能性與非功能性SNPs的區(qū)分方法其實(shí)也可以借鑒到GPCRs的研究上，例如張青青[21]通過(guò)隨機(jī)森林的方法結(jié)合變異位點(diǎn)的保守性、野生型氨基酸與突變后氨基酸理化性質(zhì)的差異、氨基酸替換頻率在致病組與中性組之間的差異、 突變位點(diǎn)周?chē)臍埢M成和突變位點(diǎn)之間的協(xié)同作用來(lái)預(yù)測(cè)nsSNPs的致病性。 Jiang等[22]在3個(gè)理化性質(zhì)（分子量、PI值、疏水性）的基礎(chǔ)上提取了26組特征，利用MSRV（Multiple selection rule voting）方法預(yù)測(cè)nsSNPs的有害性等。此外，也有根據(jù)不同算法開(kāi)發(fā)的分析軟件用來(lái)預(yù)測(cè)SNPs與疾病的相關(guān)性，例如SIFT[23]、PolyPhen[24]、SNAP[25]、MSRV[22]、LRT[26]、PolyPhen-2[27]、MutationTaster[28]、KGGSeq[29]、SInBaD[30]、GERP[31]、 PhyloP[32]和SNPranker 2.0[33]等。這些軟件基本都具備友好的使用界面，使用者一般需要提交蛋白質(zhì)序列或是蛋白質(zhì)ID號(hào)，替換的氨基酸、替換位置、染色體或者序列比對(duì)信息等，按正確格式提交后，軟件就可自行運(yùn)行然后顯示預(yù)測(cè)結(jié)果，一般都會(huì)以分值形式給出，分值范圍基本在0～1之間，分值越接近1的，表明該SNP與疾病的相關(guān)性越大，反之越小。

2 GPCR突變及多態(tài)性研究的數(shù)據(jù)庫(kù)資源

隨著GPCR研究的發(fā)展，相應(yīng)的數(shù)據(jù)資源也在不斷地補(bǔ)充和完善中，從最早的GPCRDB，到后來(lái)各種專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)的出現(xiàn)，例如gpDB、tGRAP、GPCRNaVa等，為GPCR各個(gè)方面的研究提供了數(shù)據(jù)資源，有關(guān)GPCR突變及多態(tài)性研究的相關(guān)數(shù)據(jù)資源，如表1所示。

2.1 GPCRDB

GPCRDB（G Protein-Coupled Receptors Database）仍是目前最被廣泛使用的G蛋白偶聯(lián)受體數(shù)據(jù)庫(kù)，它包含了多個(gè)物種的GPCR序列、配體結(jié)合、結(jié)構(gòu)和突變信息，以及一些通過(guò)多序列比對(duì)或是同源建模等計(jì)算方法得到的結(jié)果。其中還整合了tinyGRAP、GPCR-OKB和GPCRNaVa中的數(shù)據(jù)資源。目前最新版本2012.03.26包括來(lái)自2 098個(gè)物種的40 185條GPCR序列信息和8 235個(gè)突變信息，另外還提供了在線(xiàn)分析工具M(jìn)utationPredicter來(lái)預(yù)測(cè)點(diǎn)突變的影響效果。

2.2 tGRAP

tGRAP（G Protein-Coupled Receptors Mutant Database）早期叫tinyGRAP，是專(zhuān)門(mén)關(guān)于GPCR突變信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。里面所有的數(shù)據(jù)均取自于研究文獻(xiàn)并進(jìn)行人工注釋?zhuān)?最新版本包含來(lái)自26個(gè)物種的1 940條蛋白序列的突變信息，每條序列上都含有多個(gè)突變位點(diǎn)，并有相關(guān)的文獻(xiàn)注釋。可以通過(guò)物種、突變位置或突變類(lèi)型（插入、替換、刪除）等信息進(jìn)行搜索，同時(shí)也可以查找一些關(guān)于試驗(yàn)方面的信息（例如受體修飾位點(diǎn)、第二信使、G蛋白、質(zhì)粒等）和相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道。

2.3 GPCRNaVaDB

GPCRNaVa（Natural Variants in Human G Protein-Coupled Receptors）是關(guān)于人類(lèi)GPCR自然多變體信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，這些多變體包括罕見(jiàn)的突變和常見(jiàn)的多態(tài)性，它們對(duì)人類(lèi)表型有不同的影響，從中性到與疾病相關(guān)。GPCRNaVa整合了UniProt/SwissProt、IUPHAR、GPCRDB、dbSNP、OMIM、HGMD、tGRAP等一些在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、研究文獻(xiàn)以及病人信息來(lái)注釋人類(lèi)GPCRs上的自然多變體，每一條多變體信息包括其在DNA和蛋白質(zhì)序列上的定位，涉及到的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸、等位基因頻率，與疾病的關(guān)聯(lián)性以及相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù)和研究文獻(xiàn)的鏈接。

2.4 SNPdb

單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)（Database of Single Nuleotide Polymorphisms）收集的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)包括單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、刪除/插入多態(tài)性（DIPs）、短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs）和后移的元素插入4種類(lèi)型的數(shù)據(jù)信息。每條記錄都包括有突變點(diǎn)附近的DNA序列信息、檢測(cè)該突變點(diǎn)的試驗(yàn)條件、出現(xiàn)該突變?nèi)后w的特征描述， 以及群體或個(gè)人基因分型得到的頻率信息。該數(shù)據(jù)最新版本（2012年6月）里面收錄了人類(lèi)GPCR上的snp數(shù)據(jù)共5 313個(gè)，其中nsSNP有508個(gè)。

2.5 SNPdbe

SNPdbe（SNP Database of Effects）數(shù)據(jù)庫(kù)是以預(yù)測(cè)為主的關(guān)于錯(cuò)義SNP（nsSNP）功能注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)。目前， 大多數(shù)的多態(tài)性都缺少關(guān)于功能方面影響的試驗(yàn)注釋。SNPdbe數(shù)據(jù)庫(kù)包含了dbSNP和

1 000個(gè)基因組當(dāng)中的nsSNP信息以及Uniprot和PMD中的多變體信息，利用SNAP和SIFT算法進(jìn)一步整合PMD，OMIM和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于功能、結(jié)構(gòu)以及與疾病關(guān)聯(lián)性的信息來(lái)預(yù)測(cè)nsSNP，即單氨基酸替換（SAAS）對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。該數(shù)據(jù)庫(kù)包括130多萬(wàn)個(gè)可引起單氨基酸替換的非同義SNP信息。研究人員可以通過(guò)組織名稱(chēng)、序列以及突變ID號(hào)來(lái)進(jìn)行搜索，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化試驗(yàn)方案。

3 展望

G蛋白偶聯(lián)受體作為近幾年的“明星分子”一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行的相關(guān)研究主要集中在對(duì)受體的識(shí)別、分類(lèi)、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、 功能域分析、配體結(jié)合、與G蛋白的特異性偶聯(lián)等方面，在GPCR的突變研究中，仍以試驗(yàn)為主，通過(guò)點(diǎn)突變或是SNP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行疾病相關(guān)性分析。目前，隨著各類(lèi)突變信息數(shù)據(jù)庫(kù)的出現(xiàn)以及分析軟件的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，借助生物信息學(xué)手段進(jìn)行GPCR上功能性SNPs的研究可以為GPCR突變與疾病易感性研究開(kāi)拓新的思路，同時(shí)也可有效地提高試驗(yàn)效率。另外，隨著結(jié)構(gòu)測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，GPCR結(jié)構(gòu)信息的加入，可以更好地提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。通過(guò)預(yù)測(cè)與試驗(yàn)相結(jié)合的方法才能有效深入地了解GPCR突變的致病機(jī)理。

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