惠勇

[摘要] 目的 探討白首烏C21甾苷對(duì)慢性心力衰竭（CHF）大鼠新生血管形成及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）表達(dá)的影響，探討其防治CHF的可能作用機(jī)制。 方法 采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)建立Wistar大鼠CHF模型，隨機(jī)分為兩組：模型組（n = 8）給予等體積生理鹽水；白首烏C21甾苷組（n = 9）給予白首烏C21甾苷1.0 g/kg。另設(shè)假手術(shù)組（n = 10），給予等體積生理鹽水。3周后進(jìn)行左心室順應(yīng)性測(cè)量，并分別采用蘇木精-伊紅（HE）染色和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量微血管密度（MVD）和CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率。進(jìn)一步采用Western blot和Real-Time PCR分析檢測(cè)IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果 與模型組比較，白首烏C21甾苷組的左心室順應(yīng)性明顯改善，MVD和CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，白首烏C21甾苷組的IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 白首烏C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室順應(yīng)性，對(duì)衰竭心肌有明顯的保護(hù)作用，可通過(guò)IGF-1誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血促進(jìn)新生血管的形成。

[關(guān)鍵詞] 白首烏C21甾苷；慢性心力衰竭；新生血管形成；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R541.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）10（a）-0022-04

Effect of C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum on angiogenesis and expression of insulin-like growth factor-1 in chronic heart failure rats

HUI Yong

Department of Geriatrics， the Second People′s Hospital of Mudanjiang City， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum on angiogenesis and expression of insulin-like growth factor-1 （IGF-1） in chronic heart failure （CHF） rats and discuss its possible mechanism. Methods Anterior descending branch of left coronary artery was ligated to set up CHF Wistar rats model and rats were randomly divided into two groups： model group （n = 8） was administered equal volume of normal saline； C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum group （n = 9） was administered orally C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum according to 1.0 g/kg. Another sham group （n = 10） was administered equal volume of normal saline orally. After 3 weeks， left ventricular compliance was assessed. Microvessel density （MVD） and the positive rate of CD34+ cell was measured by HE staining and flow cytometry respectively. Further Western blot and Real-Time PCR were used to detect the protein and mRNA expression of IGF-1. Results Compared with model group， left ventricular compliance in C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum group was improved significantly， MVD and the positive rate of CD34+ cell were elevated， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with model group， IGF-1 protein and the expression of IGF-1 mRNA were enhanced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum has obvious protective effect on heart failure by improving effectively left ventricular compliance and promote the formation of neovascularization through inducing CD34+ cell mobilization to the outside blood by IGF-1.

[Key words] C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum； Chronic heart failure； Angiogenesis； Insulin-like growth factor-1

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是常見(jiàn)的心血管疾病，常伴有心血管系統(tǒng)血流動(dòng)力學(xué)障礙及神經(jīng)內(nèi)分泌代謝功能紊亂[1-2]。世界范圍內(nèi)大約有15億例CHF患者，每年新增病例400萬(wàn)例[3]。現(xiàn)階段，CHF是65歲老人住院的主要原因[4]。因此，尋找CHF安全有效的治療方法或治療藥物顯得尤為重要。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分[5]，但是，其對(duì)CHF的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察白首烏C21甾苷對(duì)CHF大鼠左心室順應(yīng)性、微血管密度（MVD）、CD34+細(xì)胞動(dòng)員及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）表達(dá)的影響，為明確白首烏C21甾苷防治CHF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)Wistar系大鼠40只，體重200～250 g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：P00102012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2012-033。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲食，12 h光照周期。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵守《中國(guó)動(dòng)物實(shí)用指南》。

1.2 白首烏C21甾苷的提取

白首烏C21甾苷由牡丹江市第二人民醫(yī)院炮制室制備。經(jīng)紫外分光光度法分析，C21甾苷含量達(dá)65%左右（按孕甾烯醇酮計(jì)）。

1.3 方法

1.3.1 心肌梗死后CHF模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 參照文獻(xiàn)[6-8]方法實(shí)施左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)建立CHF模型。共成功建立CHF模型17只，成功率為56.7%。隨機(jī)分為兩組：模型組8只，給予等體積生理鹽水；白首烏C21甾苷組9只，參照文獻(xiàn)[9]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予白首烏C21甾苷1.0 g/kg。另設(shè)假手術(shù)組10只，開(kāi)胸后在左冠狀動(dòng)脈前降支下方只穿線不結(jié)扎，等體積生理鹽水灌胃。各組均為1次/d灌胃，共3周。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 大鼠尾靜脈采血0.5 mL、枸櫞酸鈉抗凝、Pharmingen染色緩沖液稀釋。取2根試管，各加入100 μL全血，然后1管加入20 μL PE/cy5 anti-mouse CD34，另1管加入20 μL anti-CD34-FITC暗處孵育25 min后，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，上機(jī)分析，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。Cell Quest Pro軟件進(jìn)行分析CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.3.3 左心室舒張期壓力-容積曲線 大鼠斷頸處死、心包膜剪開(kāi)、肺動(dòng)脈切斷、主動(dòng)脈插管、制備Langendorff心臟。通過(guò)貝朗Infusomat P型容積輸液泵灌流改良KH（Krebs-Henseleit）灌流液。由心尖部將雙腔心導(dǎo)管引入左心室，另一端連接HM10高精度壓力傳感器。把心臟放入37℃保溫槽，逆灌10 min，改為順灌10 min，穩(wěn)定10 min。剪開(kāi)左心耳，經(jīng)左心房將自制頂端有乳膠球囊的聚乙烯導(dǎo)管插入左心室，乳膠球囊注入37℃ KH液。最初量為0.1 mL，并以此量遞增，共7次，終容積為0.7 mL，4 s/次。SLY-B四道生理記錄儀同步記錄不同球囊容積時(shí)左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張期末壓（LVEDP）、平均左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。以LVEDP為縱坐標(biāo)，左心室球囊容積為橫坐標(biāo)，繪制左心室壓力-容積曲線，以此反映心肌舒張期順應(yīng)性[10-12]。測(cè)定完成后，取心臟，剪去心房和血管組織，從心室處沿室間隔剪開(kāi)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MVD測(cè)量 心肌組織標(biāo)本4.0%多聚甲醛固定、石蠟包埋、蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察。隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野進(jìn)行拍照。Image-pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，取其平均值。

1.3.5 Western blot分析 心肌組織標(biāo)本在蛋白酶抑制劑存在下勻漿，以獲得蛋白提取物。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。95℃變性5 min，隨后進(jìn)行電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉PBST封閉1 h，分別加入抗IGF-1抗體（1∶2000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h。按同樣的方法與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體孵育。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)Bio-Rad凝膠成像進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/GAPDH蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.6 Real-Time PCR分析 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提總RNA。Nanodrop 2000檢測(cè)RNA純度。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（reverse transcriptase kit promega，Japan）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用PubMed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測(cè)出ΔC值及熔解曲線，計(jì)算出相對(duì)基因表達(dá)量。每份樣品檢測(cè)3次。

表1 Real-Time PCR序列

注：IGF-1：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 5.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心室舒張期壓力-容積曲線

隨著左心室球囊容積的逐漸遞增，與假手術(shù)組比較，模型組左心室順應(yīng)性下降（P < 0.05）。白首烏C21甾苷組可見(jiàn)曲線較模型組向左上移位（P < 0.05），說(shuō)明白首烏C21甾苷可改善CHF大鼠左心室心肌順應(yīng)性。見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；LVEDP：左心室舒張期末壓；1 mmHg = 0.133 kPa

圖1 各組大鼠左心室舒張期壓力-容積曲線

2.2 各組大鼠心肌組織MVD比較

與假手術(shù)組比較，模型組MVD明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，白首烏C21甾苷組MVD明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說(shuō)明白首烏C21甾苷促進(jìn)CHF大鼠新生血管的形成。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織MVD比較（血管數(shù)/mm2，x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；MVD：微血管密度

2.3 各組大鼠CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率比較

與假手術(shù)組比較，模型組的CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較，白首烏C21甾苷組的CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說(shuō)明白首烏C21甾苷可增強(qiáng)CD34+細(xì)胞動(dòng)員到外周血。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠CD34+細(xì)胞陽(yáng)性率比較（%，x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

2.4 各組大鼠IGF-1 Western blot分析結(jié)果

與模型組比較，白首烏C21甾苷組IGF-1表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；IGF-1：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 各組大鼠IGF-1 Western blot分析結(jié)果

2.5 各組大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR分析結(jié)果

與模型組比較，白首烏C21甾苷組的IGF-1 mRNA表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

與假手術(shù)組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；IGF-1：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖3 各組大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR分析結(jié)果

3 討論

CHF是各種心臟疾病的終末階段，是各種心臟病變引起心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化，最后導(dǎo)致心室泵血功能低下的臨床綜合征[13-16]。本研究結(jié)果表明，白首烏C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室順應(yīng)性，說(shuō)明其對(duì)衰竭心肌有明顯的保護(hù)作用。

CD34+細(xì)胞是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的共同標(biāo)志物，而且是目前公認(rèn)的外周血骨髓干細(xì)胞的標(biāo)志物[17]。CD34+細(xì)胞能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，定向遷移到缺血或損傷部位并參與局部的血管新生[18]。另有研究表明，IGF-1在CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化中也起著十分重要的作用[19]。IGF-1是重要的心源性激素，發(fā)揮類(lèi)似胰島素的作用，在新生血管的形成過(guò)程中，起決定性的作用，表現(xiàn)為表達(dá)增強(qiáng)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白首烏C21甾苷可使CHF大鼠MVD顯著增高，說(shuō)明其可促進(jìn)新生血管的形成。為確定其可能機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了外周血CD34+細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞百分率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白首烏C21甾苷可使CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血增加，提示其促新生血管形成的作用可能與動(dòng)員CD34+細(xì)胞至外周血有關(guān)。進(jìn)一步采用Western blot和Real-Time PCR分析檢測(cè)了IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白首烏C21甾苷可使IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA呈高表達(dá)。因此，認(rèn)為白首烏C21甾苷促進(jìn)新生血管的形成機(jī)制可能是其使IGF-1誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血，從而促進(jìn)新生血管的形成。

綜上所述，白首烏C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室順應(yīng)性，對(duì)衰竭心肌有明顯的保護(hù)作用。同時(shí)白首烏C21甾苷促進(jìn)新生血管的形成，其機(jī)制可能與IGF-1誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞動(dòng)員至外周血有關(guān)。

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（收稿日期：2015-07-05 本文編輯：李亞聰）