楊統(tǒng)一，高俊賢，劉 琦，連梓竹

(江蘇科技大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212018)

鄰苯二甲酸二丁酯高效降解菌的分離、鑒定及降解特性

楊統(tǒng)一，高俊賢，劉 琦，連梓竹

(江蘇科技大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212018)

從土壤中分離出1株能夠以鄰苯二甲酸二丁酯為碳源和能源生長的細菌XHYG.經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為無色桿菌(Achromobacter insolitus).對該菌株的降解條件進行優(yōu)化，確定最佳降解條件為:溫度30℃，pH=6.5～8.0.在最佳降解條件下，其在48 h內(nèi)對400 mg/L DBP降解率達到90.67%，為鄰苯二甲酸二丁酯的高效降解菌.底物降解廣譜性試驗表明，該菌株對鄰苯二甲酸二辛脂(DOP)、鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)都具有良好的降解能力，表明具備良好的底物降解廣譜性，說明該菌株在處理鄰苯二甲酸酯類化合物的污染治理中有獨特的應(yīng)用潛力.

鄰苯二甲酸二丁酯;降解特性;生物降解;降解條件;16S rDNA

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters，PAEs)是一類重要的有機化合物，被廣泛用作塑料助劑、油漆溶劑、合成橡膠增塑劑及化妝品、香味品、潤滑劑等生產(chǎn)原料中［1］.然而，由于鄰苯二甲酸酯增塑劑并非與樹脂共價連接，因此極易擴散到環(huán)境中.目前，PAEs在環(huán)境中已到了普遍檢出程度，包括在陸地生態(tài)系統(tǒng)及水域生態(tài)系統(tǒng)等都能檢測到PAEs的存在［2］.近期研究表明，PAEs具有致畸性、致突變性、致癌性及生殖毒性，可在極低濃度下干擾人和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導致其發(fā)育紊亂［3］.且在環(huán)境研究領(lǐng)域，鄰苯二甲酸酯類被中國環(huán)境監(jiān)測總站、美國國家環(huán)保局(EPA)和歐盟列為優(yōu)先控制污染物［4］.

PAEs在自然界中的降解分為生物降解和非生物降解兩種，而微生物降解是其降解的主要途徑［5］.目前國內(nèi)外有關(guān)PAEs微生物降解的研究有很多［6-7］，如 Delfia sp.［8］，Sphingomonsa sp.［9］，Arthrobacter sp.［10］，Paenibacillus sp.［11］等.但已報道的菌株能降解DBP且能降解多種鄰苯二甲酸酯類化合物的還較少，因此有必要篩選高效廣譜的DBP降解菌，豐富降解菌種類.本研究從鎮(zhèn)江市江蘇科技大學西校區(qū)垃圾處理站土樣中分離到了1株能夠高效降解鄰苯二甲酸二丁酯的細菌，采用生理生化及16S rDNA序列分析等手段對該菌進行了鑒定，并研究其生長和降解特性，以期為PAEs污染物的治理及土壤修復(fù)提供一定的科學依據(jù).

1 實驗

1.1 實驗材料

實驗土樣取自鎮(zhèn)江市江蘇科技大學西校區(qū)垃圾處理站附近土壤.

基礎(chǔ)無機鹽(MSM)培養(yǎng)基(g/L):K2HPO45.8，KH2PO44.5，(NH4)2SO42.0，MgCl20.16，CaCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.002 4，F(xiàn)eCl30.001 8，MnCl2·2H2O 0.001 5，pH=7.0，于121℃濕熱滅菌20 min.固體培養(yǎng)基為含DBP的液體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L.

富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH=7.0，于121℃濕熱滅菌20 min.

主要試劑:鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，分析純);鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP，分析純);鄰苯二甲酸二辛脂(DOP，分析純);環(huán)己烷(色譜級)，甲醇(色譜級).

1.2 實驗方法

1.2.1 DBP降解菌的篩選與純化

稱取10 g土壤樣品，加入20 ml無菌水，劇烈振蕩混合均勻后于4 000 r/min離心機中離心5 min，取上清液;接著重復(fù)此步驟2次，最后取上清液獲得土壤溶液.取分別稀釋100倍、1 000倍、10 000倍的土壤溶液，涂布在固體MSM培養(yǎng)基(含DBP 100 mg/L)于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d.然后挑取篩選的菌落接種于含DBP 200 mg/L的液體MSM培養(yǎng)基，150 r/min、30℃ 的搖床培養(yǎng)7 d，再用劃線法劃線于固體MSM培養(yǎng)基(含DBP 200 mg/L)于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，進一步分離單菌落.重復(fù)上述兩步并逐步提高培養(yǎng)基中DBP含量依次為200，250，300，350，400 mg/L.最后將分離出的單菌用富集培養(yǎng)基富集.

1.2.2 菌株的生理生化鑒定

降解菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［12］等文獻.

1.2.3 菌株DNA的鑒定

降解菌株分子生物學鑒定采用16S rDNA序列分析.首先提取分離的降解菌DNA作為模板，利用16S rDNA基因通用引物F27和R1492進行PCR擴增.其中，引物F27為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，引物R1492為5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’.

PCR擴增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s;55℃退火40 s;72℃延伸90 s，30個循環(huán); 72℃最終延伸7 min，4℃保存.

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序工作.將測序結(jié)果提交GenBank，獲得序列號KM598778，并同GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行BLAST比對，以獲得相似性較高的相關(guān)菌株，采用MEGA6.0軟件進行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.2.4 溶液中PAEs的含量測定

采用高效液相色譜法檢測溶液中PAEs，具體處理方法如下:待測溶液于超聲波振蕩器中振蕩10 min后取10 ml加入20 ml環(huán)己烷，劇烈振蕩后放入超聲波振蕩器中振蕩5 min，后倒入離心管在高速離心機(5 000 r/min)中離心分離取上層有機相，再用孔徑為0.22 μm的有機相過濾器過濾后上機測定.

高效液相色譜條件:色譜柱為5μm Eclipse XDB-C18柱;流動相為甲醇∶水=90∶10;檢測器波長為228 nm;柱溫為35℃;柱壓為15 bar;流速0.5 mL/min;進樣量為10 μL;保留時間為11 min.

1.2.5 生物量測定方法

測定菌株的生物量，采用721型可見分光光度計在600 nm處測量培養(yǎng)基的光密度OD600.

1.3 降解菌底物廣譜性測試

在基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基中分別加入鄰苯二甲酸二辛脂(400 mg/L);鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯(400 mg/L)于121℃濕熱滅菌20 min.以2%的接種量將降解菌種子液接種到100 mLMSM中，160 r/min、30℃搖床培養(yǎng).培養(yǎng)5 d后取樣，用高效液相色譜法測定不同鄰苯二甲酸酯的殘留量.

1.4 菌株的降解特性研究

1.4.1 降解菌對DBP的降解曲線及生長曲線

將菌液離心分離獲取菌體，再用MSM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌液濃度OD600=1.0.然后將上述菌液1 ml接種到液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L) 25 ml中，在150 r/min、30℃ 的搖床培養(yǎng)，并設(shè)置一組液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L)不加入菌液作為對照.每24 h定時取樣用高效液相色譜法測定其中DBP的含量，并測定其OD600值.

1.4.2 DBP高效降解菌的降解條件優(yōu)化

1)溫度

將菌株的菌液離心分離獲取菌體，再用MSM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌液濃度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分別接種到液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L)25 ml中，在150 r/min、溫度分別為25，30，35，40，45℃ 的搖床培養(yǎng)5 d，并設(shè)置一組液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L)不加入菌液作為對照.用高效液相色譜法測定其中DBP的含量.

2)pH

將菌株的菌液離心分離獲取菌體，再用MSM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌液濃度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分別接種到液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L)25 ml中，將5份培養(yǎng)基pH分別調(diào)整為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0在150 r/min、30℃ 的搖床培養(yǎng)5 d，并設(shè)置一組液體MSM培養(yǎng)基(DBP含量為400 mg/L)不加入菌液作為對照.用高效液相色譜法測定其中DBP的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株XHYG的分離及部分生理生化特征

經(jīng)過富集培養(yǎng)，分離得到1株能夠在DBP含量為400 mg/L的MSM培養(yǎng)基中很好生長的降解菌，此菌株能以DBP為唯一碳源很好地生長，將其命名為XHYG.XHYG菌株在MSM平板上于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，菌落呈圓形，不透明，黃色，中央部分突起，邊緣部分光滑，質(zhì)地致密且有光澤，不含水溶性色素，在顯微鏡下觀察為球狀.生理生化測試發(fā)現(xiàn)，菌株XHYG為革蘭氏陰性菌，接觸酶呈陽性反應(yīng)，淀粉水解酶呈陰性反應(yīng)，不產(chǎn)硫化氫氣體，明膠液化反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)均呈陰性反應(yīng)，能夠發(fā)酵葡萄糖(詳見表1).

2.2 降解菌底物廣譜性測試

接種5 d后觀察菌株XHYG都能很好地利用DOP和DEHP，根據(jù)圖1所示，菌株XHYG對DOP的降解較DEHP要好.這與文獻［13］中鄰苯二甲酸脂類的生物降解效果與碳鏈長度和復(fù)雜程度呈反比相一致.

表1XHYG菌株的部分生理生化特征Table 1 Biophysical and biochemical characteristics of strain XHYG

圖1 菌株XHYG對不同鄰苯二甲酸酯的降解Fig.1 Degradation rate of different PAEs by strain XHYG

2.3 菌株XHYG的16S rDNA分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果提交 GenBank的登錄號為KM598778.在GenBank中進行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與菌株XHYG的16S rDNA序列相似性最高的是 Achromobacter insolitus，其相似性達到99%.結(jié)合其形態(tài)學和生理生化特征，可以初步確定XHYG為無色桿菌(Achromobacter insolitus).選取部分文獻報道的PAEs降解菌，用MEGA 6.0軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，對比降解菌的系統(tǒng)進化關(guān)系.由圖2可以看出，文中篩選的XHYG菌株與無色桿菌(Achromobacter insolitus)處于同一分支，具有相同的進化距離，因而更進一步說明菌株XHYG為無色桿菌屬.從圖2還可看出，部分PAEs降解菌與XHYG菌株進化距離較遠，說明PAEs降解基因廣泛分布在不同種屬.

圖2菌株XHYG的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain XHYG

2.4 菌株XHYG的生長曲線和降解曲線

菌株XHYG的生長和降解曲線如圖3.

圖3 菌株XHYG利用鄰苯二甲酸二丁酯的生長和降解曲線Fig.3 Growth curves and degradation curves of DBP by strain XHYG

由圖3可以看出，在0～1 d時，菌株XHYG生長緩慢，DBP的降解率較低，培養(yǎng)基呈現(xiàn)淡淡的乳白色;菌株在1～3 d為遲滯期;3～5 d為對數(shù)生長期;5 d后進入平衡期;從降解曲線上來看，菌株在48 h時對400 mg/L DBP降解率達到90.67%，在3～6 d，菌株XHYG以DBP為唯一碳源和能源迅速繁殖生長，在培養(yǎng)基底部逐漸產(chǎn)生灰白色懸浮顆粒物即菌體，而DBP也被大量降解，培養(yǎng)基顏色逐漸澄清;在5～6 d時期，菌株的生長進入平衡期，其OD600穩(wěn)定在1.2左右，菌株的生長量逐漸達到最大值，DBP的殘留量僅為4.09 mg/L，降解率達到98.99%.因此，確認菌株XHYG為DBP的高效降解菌.

2.5 溫度對菌株XHYG降解DBP的影響

由圖4看出，菌株XHYG對DBP的降解效果先隨溫度的升高而升高，達到最大值后，隨著溫度的升高而降低，菌株XHYG的最適生長溫度為30℃，在溫度超過35℃后降解活性大大降低.由此表明，溫度過高或過低都會使菌株XHYG的生長受到抑制，降解活性降低.這與文獻［11］的研究結(jié)果一致.這可能由于當溫度過低時，菌體內(nèi)酶的活性在低溫下大大降低，導致菌株對DBP的降解效率降低;當溫度過高時酶活性失活導致降解效率降低.

圖4 溫度對菌株XHYG降解鄰苯二甲酸二丁酯的影響Fig.4 Effect of temperature on DBP degradation by strain XHYG

2.6 pH對菌株XHYG降解DBP的影響

由圖5可以看出菌株XHYG的最適生長pH值在6.5～8.0左右，菌株的降解率能達到85%以上，而當pH值過低或者過高時菌株的生長均受到抑制，降解活性降低.由此表明，中性環(huán)境更利于這株菌株對DBP的降解.這與文獻［16］分離出的HS-B1菌株相似，該菌株被鑒定為不動桿菌(Acinetobacter sp.)，當pH＞8.0，菌株的降解效率大大降低.

圖5 pH對菌株XHYG降解鄰苯二甲酸二丁酯的影響Fig.5 Effect of pH on DBP degradation by strain XHYG

3 結(jié)論

1)從土壤中分離得到了一株能夠以DBP為碳源和能源生長的細菌XHYG，經(jīng)過形態(tài)學特征、生理生化特征和16S rDNA序列系統(tǒng)學分析，初步鑒定該菌株為無色桿菌(Achromobacter insolitus).

2)XHYG生長和降解DBP的最佳培養(yǎng)條件為:溫度30℃，pH 7.0;在此條件下，菌株迅速利用DBP作為碳源和能源進行生長，能夠在DBP濃度為400 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中生長良好，有較高的耐受性和降解效率.

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(責任編輯:顧 琳)

Isolation and identification of highly efficient DBP-degrading strain and its degradation study

Yang Tongyi，Gao Junxian，Liu Qi，Lian Zizhu
(School of Environmental and Chemical Engineering，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang Jiangsu 212018，China)

A bacterial strain XHYG which can utilize Dibutyl phthalate(DBP)as the source of carbon and energy was isolated from soil.Based on its morphology，physiological and biochemical identification，and 16S r DNA sequence analysis，XHYG was identified as Achromobacter insolitus.The results also showed that the optimum temperature and pH for its growth and styrene-degradation were 30℃and 6.5～8.0，respectively.Under the optimal conditions，strain XHYG degraded more than 90.67%of 400 mg/L DBP within 48 h.Diversity of degradable substrates also showed that HS-B1 can efficiently utilize many other phthalate esters such as di-n-octyl phthalate(DOP)and bis(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP).It revealed that the strain XHYG has special application potential in dealing with the pollution caused by phthalate esters.

DBP;degrading characteristics;biodegradation;degradation condition; 16S rDNA

X172

A

1673-4807(2015)06-0607-05

10.3969/j.issn.1673-4807.2015.06.018

2015-03-18

國家自然科學基金資助項目(31400448);江蘇省博士后基金資助項目(1401084B);江蘇科技大學本科生創(chuàng)新計劃資助項目

楊統(tǒng)一(1980—)，男，博士，講師，研究方向環(huán)境生物技術(shù)及土壤生態(tài)學.E-mail:tongyi@just.edu.cn

楊統(tǒng)一，高俊賢，劉琦，等.鄰苯二甲酸二丁酯高效降解菌的分離、鑒定及降解特性［J］.江蘇科技大學學報(自然科學版)，2015，29(6):607-611.