■田 苗 王 瀘 朱顏澤 樸敏娟 叢立新，2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省吉林市132101；2.長白山動(dòng)植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省吉林市132101)

秸稈細(xì)胞壁含有大量木質(zhì)素，限制動(dòng)物對秸稈中纖維素、半纖維素及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，致使秸稈養(yǎng)分消化率僅為30%～40%。秸稈傳統(tǒng)處理方法為物理方法和化學(xué)方法，如粉碎、氨化等，或不能提高秸稈飼料的營養(yǎng)價(jià)值，或成本高，污染環(huán)境。而利用生物學(xué)技術(shù)對秸稈進(jìn)行處理，具有污染小、成本低、方法簡單有效等特點(diǎn)。隨著降解木質(zhì)素酶機(jī)理研究的不斷深入,挖掘出許多降解木質(zhì)素的微生物，其中白腐真菌對木質(zhì)素降解的前景廣闊。經(jīng)白腐真菌發(fā)酵的秸稈，不僅木質(zhì)素、纖維素含量有大幅度下降，而且粗蛋白含量和品質(zhì)相應(yīng)得到提高和改善[1]。

平菇是白腐真菌的一種，具有很強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力[2]。且平菇對木質(zhì)素可選擇性降解,使纖維素部分暴露出來以被反芻動(dòng)物使用。試驗(yàn)研究表明,通過平菇等真菌的降解作用,可顯著提高農(nóng)業(yè)廢棄物的營養(yǎng)價(jià)值,為動(dòng)物有效利用秸稈資源創(chuàng)造了有利條件。另外，平菇適應(yīng)性強(qiáng),易于栽培的特征,已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛的食用菌[3]。本試驗(yàn)選擇東北地區(qū)養(yǎng)殖應(yīng)用最多的玉米秸和大豆秸混合秸稈為原料，進(jìn)行平菇發(fā)酵，旨在發(fā)現(xiàn)平菇分解秸稈的規(guī)律和所需條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

本試驗(yàn)選高效木質(zhì)素分解菌糙皮側(cè)耳——平菇為試驗(yàn)菌種。菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。秸稈來源有吉林市當(dāng)?shù)夭筛畹耐晔炱谟衩捉斩捄投菇铡?/p>

1.2 培養(yǎng)基及菌種配制

1.2.1 一級培養(yǎng)基

采用PDA(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，其制作方法如下：

PDA培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 ml，自然pH值。

①馬鈴薯去皮，切成小塊，加水1 000 ml，煮沸20～30 min，用紗布濾，去馬鈴薯殘?jiān)?/p>

②加入瓊脂，加熱熔化。

③加入葡萄糖。葡萄糖溶解后，加入適量的水定容至1 000 ml。

④分裝試管，其量為管高的1/5，滅菌后制成斜面。

⑤加塞。在管口塞上棉塞。

⑥包扎。試管用線繩捆好，在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用線繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。

⑦滅菌。以0.103 MPa，121℃條件對做好培養(yǎng)基高壓蒸氣滅菌20～30 min。

⑧擱置斜面。將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，放在37℃溫箱培養(yǎng)24 h，或常溫下放置幾天后無菌生長者方可使用。

1.2.2 二級培養(yǎng)基

玉米粒培養(yǎng)基的制備。

①取玉米粒（取干燥無霉變的玉米粉碎成米粒大?。┨韵锤蓛艉笾糜谇逅薪?～3 h；

② 濾心水3～5 min，放入蒸鍋內(nèi)隔水蒸至過白心，趁熱按每千克干粒加入磷酸二氫鉀2 g、白糖20 g，拌勻冷卻后裝試管，裝置為管長的1/2，把料面壓平，塞入一塊濕棉墊（棉花浸水后略甩干）蓋住料，管口用棉花塞塞住；

③將裝好的試管培養(yǎng)基放入壓力鍋內(nèi)滅菌，水燒開后，排汽5 min后蓋上限壓閥，限壓閥孔噴汽后維持40～50 min，自然冷卻后取出接種。

1.2.3 三級培養(yǎng)基的制備

45%玉米秸稈，豆秸42%，5%石灰，8%麥麩，料水比1∶2均勻混合。玉米秸稈和豆秸要求新鮮無霉變，晾干粉碎，粒度為3～5 cm。

1.3 操作方法

一級菌種：將供試菌株擴(kuò)繁，用接種勾挑取一小塊菌塊，接種于PDA試管斜面，24℃恒溫避光培養(yǎng)。

二級菌種：挑取小塊一級菌種接種于玉米粒上，24℃恒溫避光培養(yǎng)。

三級菌種：處理好的玉米秸稈和豆秸水?dāng)嚢杈鶆蚝笱b入聚丙烯袋中，含水量為69.7%。每袋裝入濕秸稈混合物200 g，121℃高壓滅菌30 min。待秸稈溫度降至24℃以下時(shí)接種二級菌種，接種量為5%。接種后分別置于20～24℃條件下避光培養(yǎng)。

1.4 測定指標(biāo)及測定方法

平菇接種后從第20 d開始，每隔3 d取樣1次，至38 d結(jié)束進(jìn)行分析檢測。測定指標(biāo)：Ash、水分、CF、CP、粗脂肪。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇菌生長情況

二級菌種接種混合秸稈3 d后，會(huì)發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)表面出現(xiàn)白色菌點(diǎn)；在15 d時(shí)，白色菌點(diǎn)布滿基質(zhì)表面及袋壁，在基質(zhì)內(nèi)部用肉眼可以看到出現(xiàn)明顯的菌絲，同時(shí)可以聞到蘑菇香味，以后再?zèng)]有明顯變化。

2.2 平菇菌接種處理秸稈的各養(yǎng)分含量變化(見表1)

表1 平菇菌接種玉米秸稈后不同培養(yǎng)天數(shù)采樣測定的養(yǎng)分含量

由表1可知，混合秸稈經(jīng)過平菇接種處理后，粗灰分含量明顯上升，與未處理混合秸稈相比，差異顯著（P＜0.05）；粗脂肪含量有先降后升的趨勢，但較未處理組差異顯著；粗蛋白含量變化明顯，有升高的趨勢，與未處理組相比提高27.3%～42.4%，差異顯著(P＜0.05)，并在第32 d達(dá)到最高值8.22%，較未處理組相比提高42.2%，差異極顯著(P＜0.01)；粗纖維含量較未處理組明顯下降，較未處理組降低29.74%～40.10%，差異顯著（P＜0.05）。第38 d下降最多，下降40.1%，差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 玉米秸稈平菇接種處理后粗蛋白含量

由圖1顯示，平菇接種玉米秸稈后，第20～26 d秸稈樣本粗蛋白含量變化不明顯，且在第29 d有所下降。

而在第26～29 d略有回落，第29～32 d粗蛋白含量又迅速升高，并于第32 d達(dá)到峰值，之后至第38 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)出現(xiàn)持續(xù)回落現(xiàn)象。

圖2 玉米秸稈平菇接種處理后粗纖維含量

由圖2可知，處理后的混合秸稈粗纖維含量不斷下降，且下降總趨勢較平緩，第29～32 d下降幅度較大。

3 討論

玉米秸稈和豆秸經(jīng)過平菇接種處理后，秸稈粗灰分含量明顯上升，較未處理組差異顯著；粗脂肪含量上升顯著，與劉坤等[4]試驗(yàn)結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)粗蛋白含量明顯升高，較未處理組提高27.3%～42.2%，差異顯著。說明平菇菌具有分解秸稈中復(fù)雜有機(jī)化合物的能力，釋放出蛋白質(zhì)。而且微生物本身就是菌體蛋白，這樣也可以提高蛋白質(zhì)的含量。筆者認(rèn)為，用平菇發(fā)酵秸稈，大部分的低質(zhì)非蛋白氮轉(zhuǎn)化為較高質(zhì)量的菌體蛋白，這是蛋白質(zhì)升高的主要原因。魏志文等采用白腐真菌混合發(fā)酵玉米秸稈，粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到21.87%。陳敏研究了糙皮側(cè)耳（Pteurotusostreatus）和康氏木霉（Trichodenmakon-ingii）發(fā)酵稻草生產(chǎn)飼料蛋白的培養(yǎng)條件，產(chǎn)物分析結(jié)果表明，粗蛋白含量達(dá)到22.5%，趙婷靜用白腐真菌處理秸稈，發(fā)酵72～96 h玉米小麥混合秸稈的粗蛋白質(zhì)提高28.38%。宋瑞清報(bào)道相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量增加了45.85%。這些結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果雖然在提高量上有所不同，但提高的趨勢存在，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

白腐真菌分泌胞外氧化酶主要有3種，分別是漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶，這些酶對木質(zhì)素的降解有重要的作用。如果條件適宜，白腐真菌的菌絲可以分泌超纖維素酶，溶解秸稈表面的蠟質(zhì)，這樣菌絲可以進(jìn)入秸稈內(nèi)部，同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、內(nèi)切聚糖酶、外切聚糖酶降解秸稈中的木質(zhì)素和纖維素，這些降解酶既有木質(zhì)素降解酶，也有纖維素降解酶及半纖維素降解酶。過程中形成許多具有高度活性的自由基中間體，再以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方式產(chǎn)生許多不同的自由基，最后導(dǎo)致各種連接鍵斷裂，使大分子的木質(zhì)素解聚成各種低分子量片段。這樣，白腐真菌通過自身分泌的酶系，完成木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解。

平菇是最強(qiáng)大的漆酶生產(chǎn)者之一,具有很高的活性,在降解酶系中起到關(guān)鍵性作用。同時(shí)，還可以產(chǎn)生錳過氧化物酶(MnP)和藜蘆醇氧化酶(VAO),但不產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)，這些酶對木質(zhì)素和纖維素的分解都是至關(guān)重要的。

本試驗(yàn)粗纖維含量較未處理組明顯下降，第38 d下降最多，達(dá)到 40.1%，與未處理秸稈相比，差異極顯著。粗纖維的變化結(jié)果同閔小梅等[5]報(bào)道(白腐真菌可使秸稈中纖維素和半纖維素降解率達(dá)到20%～40%)相近。平菇接種玉米秸稈和豆秸混合秸稈后，隨著時(shí)間的推移，玉米秸稈和豆秸緩和秸稈的粗纖維含量不斷下降，這與Lindenfelser[6]和Teiflce[7]的研究(側(cè)菌在生長過程中基質(zhì)粗纖維含量一直呈下降趨勢)結(jié)果一致。粗纖維含量在第20～38 d下降總趨勢較平緩，而在第29～32 d有個(gè)幅度相對較大的下降，可以解釋為第29～32 d粗蛋白含迅速升高的直接原因。

本試驗(yàn)是在滅菌條件下將平菇菌接種秸稈，有試驗(yàn)表明，在非滅菌情況下密封缺氧的條件可使平菇停留在菌絲生長階段而使秸稈木質(zhì)素有顯著降解并可長期保存，此方面還有待進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

①利用平菇發(fā)酵玉米秸和豆秸的混合秸稈能有效改善其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)纖維素、木質(zhì)素的降解。

② 在20～24℃條件下，發(fā)酵32 d，蛋白質(zhì)水平最高，最高值為8.22%；發(fā)酵38 d，粗纖維含量顯著下降，達(dá)到39.59%，降低幅度達(dá)40.1%。

③利用平菇發(fā)酵秸稈，發(fā)酵時(shí)間不能低于30 d。