■唐振華 侯 宇 鄒彩霞 夏中生 韋升菊 梁 辛 李麗莉 梁賢威
(1.廣西壯族自治區(qū)水牛研究所,廣西南寧530001;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣西南寧530005)
甲酸、乙酸和丙酸等有機(jī)酸腐蝕性強(qiáng),青貯發(fā)酵初期降低pH值,為乳酸代謝提供有力條件,應(yīng)用于甘蔗尾青貯對(duì)飼料資源開(kāi)發(fā)具有重要作用。Woolford等(1975)[1]、Bosch等(1988)[2]研究表明,甲酸能夠抑制青貯中梭菌和芽孢桿菌等活動(dòng),提高青貯有氧穩(wěn)定性。而Holzer(2003)[3]早時(shí)期研究異型發(fā)酵乳桿菌代謝過(guò)程產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸是影響有氧穩(wěn)定性唯一參數(shù)。萬(wàn)江虹等(2008)[4]在甘蔗尾捆綁青貯中添加3.0 ml/kg甲酸顯著提高果糖和葡萄糖含量(P<0.05),顯著降低CP,但顯著提高氨態(tài)氮/總氮(P<0.05)。青貯品質(zhì)與有氧穩(wěn)定性是制約青貯飼料利用的重要因素,研究有機(jī)酸對(duì)甘蔗尾品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性的影響對(duì)有機(jī)酸應(yīng)用具有重要意義。因此,本試驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)在甘蔗尾青貯中添加甲酸、乙酸,研究甲酸、乙酸對(duì)甘蔗尾青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響。
青貯原料:新鮮甘蔗尾由廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)提供,采集后進(jìn)行人工切割,長(zhǎng)度為0.5 cm左右。
添加劑:甲酸、乙酸為分析純,濃度分別為88%和36%,市購(gòu)。
表1 甘蔗尾原材料營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
對(duì)照組(C)添加等量蒸餾水;試驗(yàn)組Ⅰ每千克新鮮甘蔗尾添取40 ml甲酸;試驗(yàn)組Ⅱ每千克新鮮甘蔗尾添加40 ml乙酸。每組3個(gè)重復(fù)。
1.2.2 青貯制作
將切好的甘蔗尾,每組按計(jì)量取甲酸或乙酸用生理鹽水稀釋至300 ml,均習(xí)噴灑到3 kg甘蔗尾,分裝到3個(gè)2.5 L玻璃封口瓶,密度為0.4 kg/l。對(duì)照組取等量蒸餾水。再用封口膜進(jìn)行密封,避光室內(nèi)青貯40 d。
1.3.1 常規(guī)項(xiàng)目評(píng)定
利用張英麗[5]的常規(guī)法測(cè)定水分、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)含量和酸性洗滌纖維(ADF)含量。
1.3.2 pH值及品質(zhì)項(xiàng)目分析
①樣品預(yù)處理。開(kāi)瓶后,去除上層部分,每瓶取35 g樣品,放入250 ml廣口瓶,添加150 ml超純水,置于4℃冰箱提取24 h。然后通過(guò)2層紗布進(jìn)行過(guò)濾,分裝濾液,用于pH值、乳酸、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測(cè)定。剩下的青貯甘蔗尾進(jìn)行烘干粉碎用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分以及可溶性碳水化合物(WSC)測(cè)定。
②pH值。用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定,型號(hào)為HANNA HI 8424。
③乳酸。用試劑盒進(jìn)行測(cè)定,試劑盒廠家為南京建成,貨號(hào)A019-2。原理以NAD+為氫受體,LDH催化乳酸脫氫產(chǎn)生丙酮酸,使NAD+轉(zhuǎn)化為NADH。其中PMS遞氫使NBT還原為紫色呈色物,呈色物的吸光度在530 nm時(shí)與乳酸含量呈線性關(guān)系。
④氨態(tài)氮(NH3-N)采用比色法測(cè)定。NH3-N采用苯份-次氯酸鈉比色法測(cè)定(Broderick等,1980)[6]。取得①的濾液5 ml,3 500 r/min離心10 min取上清。用(NH4)2SO4做標(biāo)準(zhǔn)品,采用美國(guó)生產(chǎn)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(PE Lambda 35型),在波長(zhǎng)560 nm下比色,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和光密度值計(jì)算出NH3-N的濃度。
⑤ 揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測(cè)定。取0.5 ml①中所得的濾液,加入等體積8.2%偏磷酸,13 000 r/min下離心10 min,取上清加入內(nèi)標(biāo)巴豆酸后,使用Agilent 7890A型氣相色譜儀,HP-INNOWAX(19091N-133)毛細(xì)管柱,毛細(xì)管柱的規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm,分析測(cè)定上清液中丙酸、乙酸及丁酸的含量。
⑥ 可溶性碳水化合物(WSC)測(cè)定。蒽酮-硫酸比色法測(cè)定[7]。在濃硫酸溶液中可溶性糖先脫水為糖醛或經(jīng)基糖醛,后與蒽酮反應(yīng)成藍(lán)綠色化合物。其顏色與含糖量成正比,吸收波長(zhǎng)640 nm。
⑦干物質(zhì)回收率(DMR):
DMR=(開(kāi)封時(shí)青貯原料質(zhì)量×青貯干物質(zhì)率)/填裝時(shí)裝入原料質(zhì)量×原料干物質(zhì)率。
1.3.3 有氧穩(wěn)定性的測(cè)定
每組混合取樣200 g置于封口袋中,用牙簽扎數(shù)個(gè)小孔,再套上1個(gè)寬松不封口的塑料袋,防止交叉污染和減少水分損失,用溫度計(jì)測(cè)定溫度變化。樣品置于陰暗處,溫度變化每8 h記錄1次,當(dāng)青貯物料的溫度超過(guò)環(huán)境溫度2℃時(shí)為止[8]。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用EXCEL軟件處理,再用SPSS 17.0軟件中的ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因子方差分析,差異顯著性以P<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn),數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。
由表2可知,Ⅱ組pH值顯著低于對(duì)照組和Ⅰ組(P<0.05),Ⅰ組和對(duì)照相比pH值差異不顯著(P>0.05);Ⅰ組乳酸含量低于檢測(cè)值,Ⅱ組乳酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);所有組都沒(méi)檢測(cè)到丙酸含量;丁酸含量各組差異不顯著(P>0.05);Ⅰ組檢測(cè)NH3-N含量低于檢測(cè)值,Ⅱ組NH3-N含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
表2 添加甲酸、乙酸對(duì)甘蔗尾青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響
由表3可知,與對(duì)照組相比,甲酸、乙酸對(duì)甘蔗尾青貯DM、DMR、NDF、ADF和CP影響差異不顯著(P>0.05),WSC含量由高到低順序?yàn)棰窠M>Ⅱ組>對(duì)照組,其中Ⅰ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
表3 添加甲酸、乙酸對(duì)甘蔗尾青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響
表4是以Kaiser[9]提出新的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)得出的各組青貯飼料評(píng)分和等級(jí)。從表4可以看出,各個(gè)組甘蔗尾青貯質(zhì)量評(píng)級(jí)均為1級(jí)。有氧穩(wěn)定性Ⅰ組較對(duì)照組高16 h,甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性有所提高。Ⅱ組溫度比室溫升高2℃所需的時(shí)間最長(zhǎng),達(dá)到176 h,有氧穩(wěn)定性最高。
表4 添加甲酸、乙酸對(duì)甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性和飼料品級(jí)影響
甲酸、乙酸和丙酸等有機(jī)酸腐蝕性強(qiáng),發(fā)酵初期降低pH值,為乳酸代謝提供有力條件。早期Wool?ford等(1975)[1]研究表明甲酸在pH值為5.0時(shí)能抑制梭菌、芽孢桿菌等生長(zhǎng),pH值為4.0時(shí)抑制包括乳酸菌在內(nèi)所有菌生長(zhǎng)。Bosch等(1988)[2]也表明甲酸能夠抑制真菌活動(dòng),減少乳酸產(chǎn)生。白春生等(2011)[10]也同樣表明添加全株玉米青貯甲酸、乙酸雖然能夠增加青貯pH值、降低乳酸含量,但抑制有害菌生長(zhǎng),顯著降低丁酸含量(P<0.05)。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致,特別是甲酸組,檢測(cè)不出乳酸存在,但丁酸含量與對(duì)照組差異不顯著,原因可能是試驗(yàn)組青貯效果均較好,酵母、梭菌等有害菌活動(dòng)均不顯著。
在早期,Bosch等(1988)[2]表明,青貯中添加甲酸能夠抑制真菌活動(dòng),保存更多可溶性糖,提高青貯品質(zhì)。呂文龍(2010)[11]研究發(fā)現(xiàn)添加甲酸能抑制乳酸菌和真菌活動(dòng),減少DM損失和WSC消耗,降低不帶穗玉米青貯發(fā)酵CP,提高發(fā)酵末期NH3-N含量。而李夢(mèng)楚(2014)[12]研究表明,青貯菠蘿莖葉中添加3.0 g/kg甲酸在減少DM損失和提高WSC同時(shí)顯著降低CP和NH3-N(P<0.05)。萬(wàn)江虹等(2008)[4]在甘蔗尾捆綁青貯中添加3.0 ml/kg甲酸顯著提高果糖和葡萄糖含量(P<0.05),顯著降低CP,但顯著提高氨態(tài)氮/總氮(P<0.05)。本試驗(yàn)添加甲酸使甘蔗尾青貯WSC含量顯著升高,這與以上研究結(jié)果一致,且檢測(cè)不出NH3-N含量,這與呂文龍(2010)[11]和萬(wàn)江虹(2008)[4]結(jié)果相反,原因除了材料不同外,還有原因可能是青貯時(shí)間較短造成。
許多研究認(rèn)為乙酸能夠抑制真菌生長(zhǎng),提高青貯有氧穩(wěn)定性[3,13]。邱小燕(2014)[14]研究表明乙酸能夠抑制全混合日糧青貯中好氧微生物和酵母生長(zhǎng),提高發(fā)酵品質(zhì)。李君風(fēng)等(2014)[15]研究表明乙酸顯著降低西藏燕麥和紫花苜蓿青貯pH值,顯著提高乳酸、WSC含量(P<0.05),這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。郭艷萍等(2010)[16]研究也認(rèn)為添加乙酸能降低高粱青貯pH值,差異不顯著(P>0.05),顯著提高乳酸含量。傅彤(2005)[13]研究表明乙酸抑制了青貯玉米初始乳酸產(chǎn)生和pH值降低,但顯著降低發(fā)酵終期pH值和NH3-N,原因是青貯過(guò)程乙酸對(duì)乳酸菌造成了選擇。本試驗(yàn)結(jié)果表明乙酸能夠顯著降低甘蔗尾青貯pH值,提高乳酸含量(P<0.05),這與上述研究結(jié)果一致,但NH3-N含量顯著提高(P<0.05),原因可能是品種和青貯時(shí)間過(guò)短造成。
Holzer(2003)[3]早時(shí)期研究異型發(fā)酵乳桿菌代謝過(guò)程產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸是影響有氧穩(wěn)定性的唯一參數(shù)。而B(niǎo)osch等(1988)[2]就表明,青貯中添加甲酸能夠抑制真菌活動(dòng),提高青貯保存效果。試驗(yàn)中甲酸和乙酸均能提高甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性,且乙酸效果最明顯,這與傅彤(2005)[13]、白春生等(2011)[10]研究結(jié)果一致。雖然甲酸添加組中乙酸含量非常低,但有氧穩(wěn)定性比對(duì)照組高,這說(shuō)明甲酸對(duì)酵母和梭菌等抑制效果很顯著。Ⅱ組中添加乙酸經(jīng)過(guò)40 d青貯,pH值為所有試驗(yàn)組最低的,雖然青貯中乙酸含量比對(duì)照組低,但有氧穩(wěn)定性最高,傅彤(2005)[13]試驗(yàn)表明,青貯有氧穩(wěn)定性不僅與乙酸含量相關(guān),還要考慮其他因素如初始pH值、以及溫度等。這也許能解釋為什么Ⅱ組乙酸含量低而有氧穩(wěn)定性高的原因。
根據(jù)Kaiser[9]提出新的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)得出的各組青貯飼料評(píng)分和等級(jí)。該標(biāo)準(zhǔn)主要是以乙酸、丁酸來(lái)評(píng)定青貯飼料發(fā)酵品質(zhì),其中乙酸反映青貯飼料有氧穩(wěn)定性和保存性能,丁酸反映青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣。而甲酸和乙酸的添加都能抑制真菌和好氧菌等有害菌生長(zhǎng),提高有氧穩(wěn)定性,降低丁酸含量,提高青貯品級(jí)。
添加甲酸與對(duì)照組相比,顯著降低甘蔗尾青貯乳酸、NH3-N含量,顯著提高WSC含量(P<0.05),提高有氧穩(wěn)定性,青貯品級(jí)為1級(jí)。添加乙酸與對(duì)照組相比,顯著降低pH值,提高乳酸含量(P<0.05),有氧穩(wěn)定性為各組最高,青貯品級(jí)為1級(jí)。