■劉 陽 熊 昊 游金明 賀 琴

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵豆粕（勃樂蛋白）和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物（酸酸乳）由上海源耀生物股份有限公司提供。發(fā)酵豆粕和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物的理化指標(biāo)見表1、表2。

表1 發(fā)酵豆粕的理化指標(biāo)(%)

表2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物的理化指標(biāo)

發(fā)酵豆粕（勃樂蛋白）是上海源耀生物股份有限公司的第三代發(fā)酵豆粕，采用單一原料豆粕，分別接種好氧微生物（1株枯草芽孢桿菌）和厭氧微生物（2株乳酸菌和1株酵母菌），采用特有設(shè)備，分別進(jìn)行全程可控的好氧和厭氧兩次獨(dú)立發(fā)酵相結(jié)合的方式，深度降解豆粕中的熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子（抗原蛋白和不良寡糖等），同時(shí)產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，成品具有濃郁的發(fā)酵香味。

嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物（酸酸乳）是上海源耀生物股份有限公司經(jīng)過4年的精心研究和反復(fù)試驗(yàn)論證，以高蛋白豆粕、奶粉、碳水化合物等為主要發(fā)酵底物，采用從健康仔豬腸道中分離獲得的嗜酸乳桿菌(菌株保藏號：CGMCC 8043)作為發(fā)酵菌株，經(jīng)過96 h的深度半液態(tài)發(fā)酵，得到一種具有高度抑制大腸桿菌的功能性優(yōu)質(zhì)蛋白原料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組設(shè)計(jì)

選用遺傳背景、胎次和體重相近的21日齡斷奶仔豬48頭，隨機(jī)分為4個(gè)處理（對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭仔豬。

1.3 試驗(yàn)飼糧

對照組仔豬飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)Ⅰ組仔豬飼喂市場反映優(yōu)良的奶粉飼糧（由某公司提供），試驗(yàn)Ⅱ組仔豬飼喂用FSBM代替10.0%普通豆粕的試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)Ⅲ組飼糧是在試驗(yàn)Ⅱ組基礎(chǔ)上用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物代替3.0%原有原料。飼糧配方參照NRC（2012）和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表3。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖基地進(jìn)行，試驗(yàn)豬在保育床上飼養(yǎng)，舍溫控制在25～27℃。自由采食和飲水，飼糧為粉料。飼養(yǎng)管理參照本品種豬的飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行，試驗(yàn)期21 d。仔豬免疫按常規(guī)程序執(zhí)行。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)

INCI中文名稱：蒙脫土，英文名Montmorillontie，CAS號：1318-93-0，又名微晶高嶺石，是一種層狀結(jié)構(gòu)、片狀結(jié)晶的硅酸鹽粘土礦，成分一般為（Na,Ca）0.33（Al,Mg）2（Si4O10）（OH）2·nH2O，單斜晶系，通常為土狀塊體。白色，有時(shí)微帶紅色或綠色，光澤暗淡，是膨潤土和漂白土的主要成分。

在試驗(yàn)第7、14、21 d從每個(gè)重復(fù)組中隨機(jī)選1頭仔豬進(jìn)行屠宰。打開腹腔，分別剪取仔豬十二指腸、空腸、回腸中段3 cm，用生理鹽水洗去食糜后置于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、攤片、貼片、常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色制成5 μm石蠟切片，采用江南BM 2000光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0軟件雙盲法讀片測量各樣本的絨毛高度（Villus Length，V是腸腺開口到絨毛頂端的垂直高度）和隱窩深度（Crypt Depth，C絨毛根部上皮凹陷到固有層的距離），每張切片觀察拍照5個(gè)視野,并計(jì)算（V/C）。

表3 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5.2 小腸上皮超微結(jié)構(gòu)

取35日齡、42日齡仔豬空腸腸段約2 cm，按照孫云子方法將腸組織樣在冰上用刀片修成大約1×1×1 mm3大小，用牙簽輕輕挑出修整好的樣品移至盛有預(yù)冷2.5%戊二醛固定液的2 ml的EP管中進(jìn)行前固定，PBS磷酸緩沖液沖洗三次，1%鋨酸后固定，PBS磷酸緩沖液沖洗三次，梯度酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100%兩次）每次15 min。純丙酮脫水兩次（15 min），EPON 812∶丙酮（1∶1）浸透30 min，純包埋液浸透1 h，純包埋液固化37℃24 h后60℃48 h。使用超薄切片機(jī)切片（BROMMA LKB-V），經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后用日立H-600透射電鏡觀察并拍照。

1.5.3 空腸黏膜二糖酶活性

于試驗(yàn)第7、14、21 d進(jìn)行屠宰取樣，從每個(gè)重復(fù)組中選取1頭體重接近仔豬，屠宰。參考Arne Dahlqvist方法制備黏膜勻漿液，即仔豬屠宰后立即取空腸15 cm，輕輕擠出腸內(nèi)容物，用4℃去離子水小心沖洗后，縱向剪開腸壁，并展開于遇冷的表面皿上。經(jīng)濾紙吸水，用載玻片小心刮取小腸黏膜，分裝在2 ml無菌凍存管中，立即放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中凍存。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的空腸黏膜，按1∶9質(zhì)量體積比加入PBS溶液，冰浴勻漿后，在4℃條件下3 000×g離心10 min。分離上清液，即為10%的小腸黏膜勻漿液。采用試劑盒（購自南京建成）測定二糖酶（蔗糖酶、乳糖酶、麥芽糖酶）、Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以重復(fù)為單位，以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。各處理數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并分析比較嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、空腸二糖酶活性的影響差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(見表4)

表4 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表4數(shù)據(jù)顯示，28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組空腸絨毛高達(dá)378.56 μm顯著高于對照組339.79 μm（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的空腸V/C顯著高于對照組（P＜0.05）。在飼糧中添加FSBM、嗜酸乳桿菌對仔豬的十二指腸、回腸絨毛高度和V/C無顯著影響（P＞0.05），并對仔豬各腸道的隱窩深度也無顯著影響（P＞0.05）。

35日齡時(shí)，試驗(yàn)組仔豬各段絨毛高度均有所提高，其中試驗(yàn)Ⅲ組的效果最好，試驗(yàn)Ⅲ組空腸絨毛高達(dá)378.66 μm，與對照組相比顯著增長15.49%，效果最佳，也顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（P＜0.05），并且試驗(yàn)Ⅱ組仔豬十二指腸、回腸的絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組的仔豬十二指腸、空腸隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05），且試驗(yàn)Ⅲ組空腸隱窩深度186.17 μm，比對照組低9.04%，且均顯著低于其他組。試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅲ組回腸隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組十二指腸、空腸、回腸的V/C都顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅲ組空腸和回腸的V/C都顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（P＜0.05）?？梢婏暳现刑砑覨SBM可促進(jìn)斷奶仔豬腸道發(fā)育，并且用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物替代原有原料3%后效果更好，在飼料中同時(shí)添加FSBM和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物與奶粉飼糧的效果相當(dāng)。

42日齡時(shí)，與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組的仔豬十二指腸絨毛高度顯著升高，隱窩深度顯著降低（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組的仔豬空腸絨毛高度達(dá)369.58 μm，顯著高于對照組和試驗(yàn)Ⅱ組；試驗(yàn)Ⅲ組空腸絨毛高度達(dá)360.04 μm，也顯著高于對照組。試驗(yàn)Ⅲ組空腸隱窩深度與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組的仔豬十二指腸、空腸V/C均顯著升高（P＜0.05），并且試驗(yàn)Ⅰ組十二指腸的V/C高達(dá)2.22，與對照組相比升高了15.63%。

2.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響(見圖1)

由圖1可看出，對照組微絨毛比較稀疏，疏密不等，部分絨毛存在脫落和損傷跡象。飼糧中添加FSBM后仔豬空腸上皮微絨毛相對密集、整齊，并在添加FSBM的基礎(chǔ)上再添加嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物仔豬空腸微絨毛更纖細(xì)、密集。奶粉飼糧組的仔豬空腸微絨毛更密集、整齊、纖細(xì)于對照組。

2.3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響(見表5)

從表5數(shù)據(jù)可知，28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組仔豬空腸蔗糖酶活性達(dá)53.96 U/mg prot，顯著高于對照組（33.08 U/mg prot）（P＜0.05），但與試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組相比差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組仔豬空腸蔗糖酶活性較高，也顯著高于對照組仔豬空腸蔗糖酶活性（P＜0.05）。在35日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的蔗糖酶活分別性達(dá)99.87、89.60、95.89 U/mg prot，與對照組相比均顯著升高（P＜0.05）。42日齡時(shí)，仔豬空腸蔗糖酶活性與28日齡、35日齡時(shí)相比均獲得提高；試驗(yàn)Ⅲ組仔豬空腸蔗糖酶活性達(dá)141.78 U/mg prot，顯著高于對照組(104.20 U/mg prot)?？梢婏暳现刑砑覨SBM可提高仔豬空腸蔗糖酶活性，并用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物替代原有原料3%后的效果更好。

仔豬在28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組的空腸乳糖酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），且試驗(yàn)Ⅰ組的空腸乳糖酶活性達(dá)到216.29 U/mg prot，該數(shù)據(jù)接近對照組122.44 U/mg prot的2倍，試驗(yàn)Ⅲ組仔豬空腸乳糖酶活性達(dá)193.08 U/mg prot，與對照組相比顯著升高了57.7%（P＜0.05）。35、42日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅲ組仔豬空腸乳糖酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05）。

由表中數(shù)據(jù)可得出，添加FSBM和嗜酸乳桿菌對28日齡仔豬空腸麥芽糖酶活性無顯著影響，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組空腸麥芽糖酶活性水平分別達(dá)到201.47 U/mg prot、199.31 U/mg prot，與對照組相比提高29.5%、28.2%。在35日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組空腸麥芽糖酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）。42日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組的空腸麥芽糖酶活性顯著高于對照組和試驗(yàn)Ⅰ組（P＜0.05），且試驗(yàn)Ⅲ組的最高。本試驗(yàn)對仔豬空腸Na+/K+-ATP酶活性和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性無顯著影響，但在28、35日齡時(shí)試驗(yàn)組數(shù)據(jù)要高于對照組，并且試驗(yàn)Ⅲ組最高。

3 討論

3.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

眾多研究表明，豆粕經(jīng)發(fā)酵后，可大大提高營養(yǎng)價(jià)值，能去除多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，尤其是抗原蛋白水平,同時(shí)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量益生菌、乳酸、小肽及游離氨基酸等物質(zhì),對幼齡動(dòng)物的生長和胃腸發(fā)育具有促進(jìn)作用(Feng等，2007；陳成等，2005；李文剛等，2005)。Kiers(2003)研究發(fā)現(xiàn)，飼喂FSBM可顯著改善仔豬的胃腸道發(fā)育。馮杰等研究發(fā)現(xiàn)，用FSBM代替普通豆粕可以減輕飼糧中大豆抗原蛋白對腸道的過敏損傷，能較好地維持腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂FSBM的斷奶仔豬腸道絨毛高度、隱窩深度及V/C均有不同程度的改善，能夠較好地保護(hù)斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，且在35日齡的效果最好，這與上述研究結(jié)果一致。

圖1 仔豬空腸橫切透射電鏡圖(×6 000)

有研究報(bào)道，微生態(tài)制劑添加于畜禽日糧中能夠產(chǎn)生對動(dòng)物生長有益的有機(jī)酸、小肽和必需的維生素；改善動(dòng)物腸道發(fā)育和促進(jìn)動(dòng)物健康，提高動(dòng)物機(jī)體免疫功能等多種生理功能，從而達(dá)到提高動(dòng)物生產(chǎn)性能及維護(hù)動(dòng)物機(jī)體健康的目的。徐基利等發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可提高畜禽腸道平均絨毛高度和隱窩深度。劉虎傳等在早期斷奶仔豬飼糧中添加益生菌研究發(fā)現(xiàn)可以緩解早期斷奶應(yīng)激對絨毛高度和隱窩深度的影響。本試驗(yàn)在用發(fā)酵豆粕代替的基礎(chǔ)上添加嗜酸乳桿菌對小腸絨毛高度、隱窩深度、V/C的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，得到和上述一樣的結(jié)果，能有效地降低斷奶應(yīng)激引起的腸道絨毛脫落，改善腸道結(jié)構(gòu)完整性，促進(jìn)小腸絨毛生長，抑制隱窩細(xì)胞增生。馬治宇等利用前期從肉雞盲腸中分離的一株嗜酸乳桿菌DL1株（LA-DL1）制成凍干粉劑，添加到蛋用雛雞飼料中也得出相似的結(jié)果。

表5 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶指標(biāo)的影響（U/mg prot）

3.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬上皮超微結(jié)構(gòu)的影響

通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)果與Kiers等(2003)、馮杰等(2007)、徐基利等(2011)、劉虎傳等(2012)研究一致，即日糧中添加FSBM和嗜酸乳桿菌能使仔豬空腸絨毛相對較整齊、粗長、密集。用FSBM替代普通豆粕可以改善仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育，并且在FSBM中添加嗜酸乳桿菌效果更佳。

3.3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響

小腸二糖酶是碳水化合物消化吸收至關(guān)重要的酶。假如消化道黏膜沒有二糖酶的存在，就沒有單糖的吸收、轉(zhuǎn)化和利用。故有學(xué)者建議將消化酶的發(fā)育作為小腸分化和衡量對飼糧適應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。麥芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶是3種最重要的二糖酶，分別將麥芽糖、蔗糖和乳糖分解成相應(yīng)的單糖而被動(dòng)物吸收利用(Siddons等，1972)。微生物發(fā)酵的過程可以降解大分子蛋白為小肽，有研究表明這些小肽能促進(jìn)消化道發(fā)育，刺激消化酶的分泌與激活。研究表明，用微生物FSBM代替普通豆粕對小腸二糖酶活性有一定的影響。劉濟(jì)(2012)用FSBM代替普通豆粕飼喂AA肉雞后，試驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕能促進(jìn)AA肉雞腸道消化酶的激活與分泌，提高消化酶活性。Kiers等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，豆粕通過發(fā)酵使大豆內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生生化反應(yīng)導(dǎo)致其可溶性及消化率明顯得到提高。本研究斷奶仔豬日糧中用FSBM代替普通豆粕后發(fā)現(xiàn)，在28日齡時(shí)可顯著提高蔗糖酶活性，維持乳糖酶活性在較高水平，隨著日齡的增加乳糖酶活性逐漸降低。35、42日齡可顯著提高麥芽糖酶活性，并隨著日齡的增加呈上升的趨勢，這與Hartman等(1961)研究結(jié)果一致。

飼糧中添加3%的嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)，仔豬空腸三種二糖酶活性都有所提高，這說明在飼糧中添加FSBM和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物能促進(jìn)斷奶仔豬腸道消化功能的提早發(fā)育。

4 結(jié)論

①仔豬飼糧用FSBM代替10%普通豆粕可改善仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)仔豬小腸黏膜發(fā)育。

②仔豬飼糧用FSBM代替10%普通豆粕可減弱斷奶應(yīng)激引起的乳糖酶急劇下降，提高蔗糖酶、麥芽糖酶活性，但對仔豬空腸Na+/K+-ATP酶活性和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性影響不大。

③在適當(dāng)降低FSBM用量的同時(shí)，添加3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物可以更好地改善仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高消化酶活性，其效果與奶粉飼糧相當(dāng)。

（參考文獻(xiàn)21篇，刊略，需者可函索）