張俊杰，馬旭，廖源，王澍，林開(kāi)文

(1．西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，云南 昆明650224;2．福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州350002)

桂花(Osmanthus fragrans)屬木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)植物，乃常綠灌木或小喬木，為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，有兩千多年的栽培歷史。我國(guó)是木犀屬植物和桂花品種資源的世界分布中心［1］。桂花按照花期和花色，可分為銀桂品種群、金桂品種群、丹桂品種群和四季桂品種群，各品種群下再劃分品種。與梅花、牡丹等其他傳統(tǒng)名花相比，不論在品種分類(lèi)、品種起源和演化規(guī)律的研究都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，桂花原產(chǎn)我國(guó)西南部，四川、云南、廣西等地均有野生。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，云南百年以上樹(shù)齡的桂花有21 株［2］。2009 年翟麗麗［3］調(diào)查出昆明市三環(huán)內(nèi)桂花有30個(gè)品種。而其他云南省桂花的相關(guān)研究很少，沒(méi)有體現(xiàn)其資源優(yōu)勢(shì)。昆明作為云南省省會(huì)，屬亞熱帶高原季風(fēng)氣候，夏無(wú)酷暑，冬無(wú)嚴(yán)寒，素以“春城”而享譽(yù)中外，獨(dú)特的環(huán)境氣候造就昆明獨(dú)有的桂花品種。因此，發(fā)掘并研究昆明潛在的桂花品種對(duì)我國(guó)桂花種質(zhì)資源的拓展尤為重要。

近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究桂花的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，如同工酶分析、RAPD標(biāo)記、ISSR-PCR標(biāo)記、AFLP分析等。ISSR(inter-simple sequence repeat)即簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)單、DNA用量少、重復(fù)性高、成本低等特點(diǎn)［4］，在桂花品種鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇和品種的進(jìn)化研究方面有廣泛的應(yīng)用前景［5～6］。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)昆明市區(qū)的56個(gè)桂花品種 (包括10個(gè)待定品種)和4個(gè)品種群間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為昆明桂花品種資源鑒定和選育提供理論依據(jù)，從而培育出更多觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng)的名優(yōu)桂花新品種。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料選用2012年7月至2013年10月在昆明市五城區(qū)各類(lèi)型綠地調(diào)查到的56個(gè)桂花品種，木犀屬的2個(gè)對(duì)照種華東木犀 (Osmanthus cooperi，采集于昆明世博園)和云南木犀(O．yunnanensis，采集于西南林業(yè)大學(xué))共58份材料。包含了桂花的4個(gè)品種群，其中四季桂品種群品種5個(gè)，銀桂品種群品種18個(gè)，金桂品種群品種16個(gè)，丹桂品種群品種7個(gè)，根據(jù)形態(tài)和花色暫命名的待定品種10個(gè) (表1)。將資源調(diào)查中采集的無(wú)病蟲(chóng)害的幼嫩葉片放入自封袋中，立即加入硅膠干燥，于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 58個(gè)木犀屬植物試驗(yàn)材料Tab．1 58 test material of Osmanthus genus plants

續(xù)表1

注:編號(hào)1～5屬四季桂品種群;6～11，16～27屬銀桂品種群;34～49屬金桂品種群;50～56屬丹桂品種群;待定品種用“*”表示，12～15為結(jié)實(shí)待定品種，28～33為不結(jié)實(shí)待定品種。

1.2 方法

1．2．1 DNA 提取

采用OMEGA HP Plant DNA Kit試劑盒提取樣品基因組DNA，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA的純度，用1．0%的瓊脂糖在1×TAE液里電泳檢測(cè)純度，存放入-20℃冰箱中備用。

1．2．2 引物篩選

引物選用美國(guó)哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物序列與相關(guān)文獻(xiàn)里的兩條引物［6，8～9］ISSR12、ISSR27共102條引物，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、豐富、彌散較少的24條引物。

1．2．3 ISSR-PCR 擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)采用 Takara Mix代替 dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶與buffer。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL 體系，含 Mix 12．5 μL，10 mol/L 的引物 1 μL，50 ng桂花樣品DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50～54℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1．5 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。對(duì)58個(gè)樣品進(jìn)行正式擴(kuò)增，每個(gè)引物擴(kuò)增兩次。PCR產(chǎn)物在以Goldview I為燃料的2．0%的瓊脂糖凝膠電泳，用5 μL PCR產(chǎn)物上樣，恒壓100 v，電泳時(shí)間45 min，取出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)分子標(biāo)記的有無(wú)記錄成二元數(shù)據(jù)，相同位點(diǎn)上有帶的位置記為1，無(wú)帶或帶不清晰的位置記為0，錄入Excel表格，導(dǎo)入Pop Gene Version 1．32軟件進(jìn)行遺傳分析。用NTSYSpc2．1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用UPGMA法聚類(lèi)分析，繪出58份材料的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物擴(kuò)增多態(tài)性

將篩選出的24個(gè)引物對(duì)供試材料進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng) (表2)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的大小主要集中在300～1 800 bp之間，共擴(kuò)增出251個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)達(dá)243個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為96．81%。每個(gè)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)在7至14個(gè)之間。平均每個(gè)引物擴(kuò)增位點(diǎn)10．46個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)10．13個(gè)。多態(tài)性比率達(dá)到 100%的引物有UBC810、UBC811等共17個(gè)。引物 UBC841的多態(tài)性位點(diǎn)比率最低，為77．78%。引物UBC823、ISSR12的擴(kuò)增圖譜 (圖1)。

表2 24條ISSR引物序列及對(duì)供試桂花品種的擴(kuò)增結(jié)果Tab．2 24 ISSR primers and amplification results of tested Osmanthus fragrans Cultivars

圖1 引物UBC823、ISSR12對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果Fi g．1 Ampl i f i cat i on r esul t s of t est ed mat er i al s wi t h pr i mer UBC823 and ISSR12

2.2 ISSR遺傳距離和聚類(lèi)分析

58份材料的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2，以遺傳相似系數(shù)0．726為截值，可將材料分為4類(lèi)。第Ⅰ類(lèi)為2個(gè)四季桂品種:長(zhǎng)梗素花、日香桂。第Ⅱ類(lèi)包括了四季桂、金桂、銀桂和丹桂4個(gè)品種群的54個(gè)品種，占供試桂花品種的96．43%。第Ⅲ類(lèi)和第Ⅳ類(lèi)分別為對(duì)照種華東木犀、云南木犀。此時(shí)桂花56個(gè)品種已與木犀屬2個(gè)對(duì)照種區(qū)分開(kāi)。聚類(lèi)結(jié)果提煉到摘要中去。

以遺傳相似系數(shù)0．760為截值，可把第Ⅱ類(lèi)的54個(gè)桂花品種分為7個(gè)組。第1組為四季桂、銀桂、金桂3個(gè)品種群共38個(gè)品種組成的混合類(lèi)型。含大葉佛頂珠等3個(gè)四季桂品種，波葉銀桂等13個(gè)銀桂品種，潢川金桂等12個(gè)金桂品種和10個(gè)待定品種。第2組和第3組均含2個(gè)不結(jié)實(shí)的銀桂品種:長(zhǎng)梗白和銀粟，圓葉銀桂和白潔。第4組含麗黃等3個(gè)金桂品種和醉肌紅等4個(gè)丹桂品種。第5組為金桂品種金球桂。第6組含朝霞等3個(gè)丹桂品種。第7組為銀桂品種大葉銀桂。

以遺傳相似系數(shù)0．790為截值，第Ⅱ類(lèi)第1組中天香臺(tái)閣等3個(gè)四季桂品種與銀桂品種長(zhǎng)葉碧珠，待定品種厚瓣籽銀桂聚類(lèi);2個(gè)銀桂品種垂瓣、銀星聚類(lèi);待定品種昆明多瓣籽銀桂單獨(dú)聚類(lèi);2個(gè)待定品種春城早黃和春城散花優(yōu)先聚類(lèi)，再與潢川金桂等3個(gè)金桂品種聚類(lèi);銀桂品種早籽銀與金桂品種小葉籽金桂聚類(lèi);金桂品種大葉黃，2個(gè)銀桂品種波葉銀桂、米花籽銀桂和3個(gè)待定品種長(zhǎng)梗白籽銀桂、迷你銀桂、柳葉籽銀桂聚類(lèi);銀桂品種籽銀桂，2個(gè)待定品種小銀鈴、三瓣早黃和晚金桂等4個(gè)金桂品種聚類(lèi);鐮葉金桂與香云等3個(gè)銀桂品種聚類(lèi);金桂品種垂枝黃與2個(gè)銀桂品種柳葉桂、青尖聚類(lèi);銀桂品種厚瓣銀桂、待定品種春城齒葉銀桂和金桂品種麩金聚類(lèi)。第4組2個(gè)金桂品種球桂、波葉球桂和丹桂品種醉肌紅聚類(lèi);杭州丹桂等3個(gè)丹桂品種聚類(lèi)。

10個(gè)待定品種花色較淺，根據(jù)其形態(tài)特征和聚類(lèi)分析結(jié)果，可推測(cè)均為銀桂品種群的品種。據(jù)此，以下研究均把10個(gè)待定品種歸屬于銀桂品種群。

圖2 供試材料的ISSR聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig．2 ISSR dendrogram of cluster analysis for 56 cultivars and 2 contrast of Osmanthus

2.3 ISSR遺傳多樣性

遺傳多樣性研究對(duì)充分認(rèn)識(shí)桂花品種，有效保護(hù)桂花品種資源，全面、合理地開(kāi)發(fā)云南的桂花品種資源具有重要的理論和應(yīng)用意義。根據(jù)電泳圖譜條帶分析得出桂花不同品種群的遺傳多樣性指數(shù)(表3)。在4個(gè)品種群中，銀桂品種群的觀察等位基因數(shù) (1．828 7)、有效等位基因數(shù) (1．301 6)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù) (0．188 5)、Shannon 多樣性指數(shù) (0．300 9)和位點(diǎn)多態(tài)性比率 (82．87%)皆最高。各品種群的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)比率排列順序?yàn)?，銀桂品種群＞金桂品種群＞四季桂品種群＞丹桂品種群。

4個(gè)桂花品種群群體總基因多樣性指數(shù)為0．247 4，種群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)為0．112 6，種群間遺傳多樣性比率為54．49%，種群內(nèi)遺傳多樣性比率為45．51%，表明桂花品種群之間的變異大于品種群之內(nèi)的變異。

表3 4個(gè)品種群ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)Tab．3 ISSR maker-based Genetic variation index of 4 Osmanthus fragrans groups

2.4 ISSR遺傳距離和遺傳相似系數(shù)

根據(jù)電泳圖譜條帶分析桂花4個(gè)桂花品種群間和2個(gè)木犀屬對(duì)照種的ISSR遺傳相似系數(shù)和遺傳距離 (表4)。遺傳距離在0．014 0～0．475 6之間。遺傳距離最大的在2個(gè)對(duì)照種華東木犀與云南木犀之間 (0．475 6)，2個(gè)對(duì)照種與桂花4個(gè)品種群之間的遺傳距離均≥0．217 0。而在桂花4個(gè)品種群之間，銀桂、金桂、四季桂品種群與丹桂品種群的遺傳距離較遠(yuǎn)，而四季桂品種群與丹桂品種群的遺傳距離最遠(yuǎn) (0．093 9);銀桂品種群與金桂品種群之間的遺傳距離最近 (0．014 0)。

表4 4個(gè)品種群和2個(gè)木犀屬對(duì)照種的ISSR遺傳相似系數(shù)和遺傳距離矩陣Tab．4 Genetic similar coefficient and genetic distance matrix of 4 Osmanthus fragrans groups and 2 controls

根據(jù)ISSR遺傳相似系數(shù)生成桂花4個(gè)品種群和2個(gè)對(duì)照種的ISSR聚類(lèi)圖見(jiàn)圖3，銀桂品種群與金桂品種群先聚在一塊，再與四季桂品種群聚在一起，花色較淺的3個(gè)品種群聚在一塊后，再與丹桂品種群聚在一塊。2個(gè)對(duì)照種華東木犀、云南木犀與桂花4個(gè)品種群之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與各桂花品種群明顯區(qū)分開(kāi)。

圖3 基于Nei’s遺傳相似系數(shù)的桂花4個(gè)品種群及2個(gè)對(duì)照種的ISSR聚類(lèi)圖Fig．3 ISSR clustering dendrogram based on Nei’s genetic similar coefficient of 4 Osmanthus fragrans groups and 2 controls

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究中天香臺(tái)閣等3個(gè)四季桂品種與厚瓣籽銀桂、長(zhǎng)梗素花2個(gè)銀桂品種聚類(lèi)，證明了銀桂品種與四季桂品種親緣關(guān)系較近?；ㄉ珳\黃白的銀桂品種與花色淺黃的金桂品種聚類(lèi)，花色金黃的金桂品種與花色最淺的丹桂品種醉肌紅聚類(lèi)，表明同一品種群內(nèi)的品種，各品種群之間花色相近的品種大多聚類(lèi)。本研究中大葉銀桂、金球桂單獨(dú)聚類(lèi)，表明同一品種群內(nèi)某些花色相近的品種聚類(lèi)分散，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，它們的遺傳變異程度和遺傳分化程度較高。從10個(gè)待定品種的聚類(lèi)方式可知，待定品種均為銀桂品種。因此調(diào)查出的昆明銀桂品種多達(dá)28個(gè)，占供試桂花品種的50%，說(shuō)明銀桂品種在昆明的演化變異較多，形態(tài)和基因多樣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桂花品種之間遺傳多樣性豐富，桂花品種群之間的變異大于品種群之內(nèi)的變異，各品種群多態(tài)性位點(diǎn)比率依次為:銀桂品種群＞金桂品種群＞四季桂品種群＞丹桂品種群。通過(guò)4個(gè)品種群的ISSR聚類(lèi)圖分析，銀桂品種群與金桂品種群優(yōu)先聚類(lèi)，再與四季桂品種群聚類(lèi)，最后與丹桂品種群聚類(lèi)。

3.2 討論

銀桂品種與四季桂品種親緣關(guān)系較近的觀點(diǎn)，與用同工酶、AFLP 技術(shù)和胡紹慶的 ISSR-PCR［5，10～11］分析得出的觀點(diǎn)一致。花色相近的品種聚類(lèi)，與上海、湖北、杭州、江蘇等地區(qū)［5～8，11～13］的研究結(jié)論一致。說(shuō)明花色作為桂花品種形態(tài)學(xué)上重要的分類(lèi)依據(jù)，得到許多分子水平研究的驗(yàn)證。至于同一品種群內(nèi)某些花色相近的品種聚類(lèi)分散，這可能由于跟花色有關(guān)的基因在桂花的基因組中所占分量不大，不同桂花品種間相互雜交選育導(dǎo)致其種質(zhì)資源混雜，以花色為分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)沒(méi)能確切反映桂花品種間的親緣關(guān)系［12，14］。另外，春城早黃與三瓣早黃親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而其形態(tài)上相似，這可能由于植物體的內(nèi)部構(gòu)造和形態(tài)建成復(fù)雜，DNA水平上的相似在生理或形態(tài)上可能差距較遠(yuǎn)［15］，這些具體原因有待進(jìn)一步研究。

桂花各品種群多態(tài)性位點(diǎn)比率與李梅、梁麗麗的研究成果［6，8］不完全相同。可能是由于云南特殊地理環(huán)境和長(zhǎng)期栽培選育造成與其他地區(qū)的品種群多態(tài)性位點(diǎn)比率不一致。

4個(gè)品種群的ISSR聚類(lèi)方式不同于李梅［6］的秋桂類(lèi)3個(gè)品種群優(yōu)先聚類(lèi)，再與四季桂品種群聚類(lèi)。從花色角度來(lái)看，金桂品種群、銀桂品種群先和花色較淺的四季桂品種群聚類(lèi)有一定形態(tài)學(xué)支撐，也以基因角度印證了藏德奎比較形態(tài)學(xué)研究［16～17］提出的秋桂類(lèi)3個(gè)品種群是從銀桂進(jìn)化到金桂再進(jìn)一步顏色加深進(jìn)化到丹桂的推論。

10個(gè)待定品種若再經(jīng)一段時(shí)間的觀察，性狀穩(wěn)定后可擴(kuò)繁并推廣到園林中，成為昆明特有的品種品牌。厚瓣籽銀桂和昆明多瓣籽銀桂為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)實(shí)品種，可與親緣關(guān)系較近的國(guó)內(nèi)常見(jiàn)品種長(zhǎng)葉碧珠進(jìn)行雜交授粉，獲得的新品種有望繼承長(zhǎng)葉碧珠的生態(tài)習(xí)性，可推廣到平原地區(qū)栽植。待定品種春城早黃、春城散花與潢川金桂、小花金桂、垂花金桂等3個(gè)金桂品種聚類(lèi)，這5個(gè)品種均花量大、花期較長(zhǎng)、花色較艷，在昆明生長(zhǎng)良好，由于親緣關(guān)系較近導(dǎo)致優(yōu)良品性類(lèi)似，值得大量繁殖推廣。

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