王燕，賴普輝

(陜西國際商貿學院醫(yī)藥學院，陜西 咸陽712046)

玉米須，又稱龍須，為禾本科玉蜀屬植物玉米的花柱和柱頭［1］，其性平、味甘、無毒，具有利尿、平肝、利膽、抗氧化、增強免疫力、清除自由基等功效［2］。玉米須含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油、維生素C、維生素K、甾醇及各種有機酸等多種活性成分［3～4］，是2010版《中國藥典》中藥一部收錄的品種之一，主要用于高血壓、糖尿病、水腫、腎結石等疾病的治療。玉米須中富含具備生理功能的活性物質黃酮。黃酮類物質具有抑菌、止血、抗氧化、保護心腦血管等作用，已引起人們的廣泛關注［5］。玉米在中國種植廣泛，玉米須長期以來被當作玉米生產中的副產物，僅有少量入藥，其余均被丟棄，造成資源極大浪費。從玉米須中提取黃酮類物質，對其進行開發(fā)研究，具有廣泛的開發(fā)前景［6］。

微波輔助提取法與超聲波及傳統(tǒng)提取方法相比，具有設備簡單、高效、節(jié)能、污染小等的特點［7］，廣泛應用生化、食品、天然產物提取等領域。白建華等以微波輔助提取法對玉米須黃酮進行提取，采用正交實驗法進行工藝優(yōu)化，最終提取率為1．13%［8］;張艷采用超聲波加酶法提取玉米須黃酮，提取率1．26%［9］;李俠等將超聲波-雙酶法結合提取玉米須黃酮，提取率為0．86%，比傳統(tǒng)方法提取率高［10］;周鴻立等采用正交實驗法，對微波法和熱回流法提取成熟期玉米須黃酮的工藝進行優(yōu)化，提取率分別為 4．55%和 3．17%［11］。目前尚未見到響應曲面法優(yōu)化玉米須總黃酮的微波輔助提取工藝的報道。

本研究以中國豐富的成熟期的玉米須資源為實驗材料，采用響應曲面法中Box-Behnken Design(BBD)進行實驗設計，對微波輔助法提取玉米須黃酮的工藝進行優(yōu)化，為深度開發(fā)這一天然資源提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米須 (成熟期)，產地河南，購自西安藥材市場，洗凈、曬干、粉碎，干燥通風處保存。蘆丁，購自中國 (長春)藥品生物制品檢定所。氫氧化鈉、硝酸鋁分析純、亞硝酸鈉、無水乙醇等均為國產分析純。800型離心沉淀器 (上海手術儀器廠)，旋轉蒸發(fā)器RE-52型 (上海青蒲滬西儀器廠)，電子分析天平FA型 (上海恒平科學儀器有限公司)，循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)型 (鞏義市英峪儀器廠)，電子恒溫水浴鍋DZKW-4型 (上海金橋科析儀器廠)，電熱真空干燥箱ZK-82A型(上海試驗儀器廠有限公司)，紫外可見分光光度計724型 (上海精密儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1．2．1 玉米須總黃酮的提取

稱取一定量粉碎的玉米須粉，加入一定濃度乙醇溶液，經微波提取后離心，取上層清液備用。

1．2．2 標準曲線的制作

精密稱取0．155 0 g蘆丁，用70%乙醇溶解后完全轉入50 mL容量瓶中，定容。分別取對照品溶液0．0 mL、0．5 mL、1．0 mL、1．5 mL、2．0 mL、2．5 mL、3．0 mL于10 mL棕色容量瓶中，隨后用70%乙醇補充至5．0 mL，0．30 mL 4%NaNO2溶液、搖勻、靜置5 min后加入0．30 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻、靜置6 min后加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，靜置15 min，以70%乙醇定容至刻度。以70%乙醇為空白，在200～700 nm之間用紫外-可見光進行掃描，測定吸光度，以獲取蘆丁的最大吸收波長。在最大吸收波長下，以70%乙醇為空白，以不同濃度照品質量濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度值 (A)為縱坐標，繪制標準曲線。

1．2．3 樣品的測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉法，將精密移取0．5 mL提取液于10 mL量瓶中，以試劑空白作為參比，按照1．2．2方法進行測定，計算玉米須總黃酮提取率。

1．2．4 Box-Behnken 實驗設計

單因素實驗結果表明，影響玉米須總黃酮提取的主要因素:微波功率、提取時間和液固比，將其分別用A、B和C表示。根據響應曲面優(yōu)化法中的Box-Behnken實驗設計原理，對因素的高、中、低水平分別以+1、0、-1進行編碼 (表1)。

表1 BBD實驗設計的因素與水平Tab．1 Experimental levels employed for Box-Behnken design

1．2．5 數據處理

采用用統(tǒng)計軟件Design Expert 7．1．0對實驗數據進行分析，建立實驗模型，并進行相關的顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

按照1．2．2方法，在200～700 nm間對蘆丁對照品溶液進行紫外可見光譜掃描，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標的蘆丁紫外吸收曲線 (圖1)。可以確定的最大吸收波長為510 nm。

圖1 蘆丁紫外吸收曲線Fig．1 Rutin UV absorption spectrum

2.2 標準曲線的繪制

在最大吸收波長510 nm條件下，繪制對照品濃度與吸光度的標準曲線 (圖2)。對圖中的數據進行線性回歸得盧丁對照品濃度C(mg/mL)與吸光度值 (A)的方程為 A=0．591C-0．001(R2=0．999 7)，呈現良好的線性關系。

圖2 盧丁標準品的標準曲線Fig．2 Standard absorbance curve of Luteolin

2.3 響應曲面實驗結果與分析

2．3．1 響應曲面實驗結果

按照響應曲面法的BBD設計方法，得到17個實驗點的設計方案 (表2)。其中12個實驗點為析因點，5個為零點。析因點為自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，重復試驗5次，用以估算試驗誤差。

2．3．2 回歸模型方程的建立及其顯著性檢驗

以總黃酮提取率Y(%)為響應值，通過Design Expert 7．1．0軟件對表2試驗結果進行擬合分析，獲得多元二次回歸方程為:Y=1．367-0．081 A+0．117B-0．071C-0．041AB+0．141AC-0．120BC-0．382A2-0．433B2-0．409C2(R2=0．978 4)。

由于回歸方程中各項系數絕對值大小反映了各因素對響應值的影響程度，則影響總黃酮提取率的因素大小順序為B＞A＞C。為驗證模型的有效性，進行方差分析和顯著性檢驗 (表3)。

表2 BBD實驗設計和實驗結果Tab．2 Box-Behnken design and observed responses

模型的P值小于0．05，表明本研究采用的多元二次模型方程具有高度的顯著性;失擬項P值為0．062 6，失擬不顯著，表明實驗誤差小，方程擬合程度較好，該方程可以反映出真實的實驗過程。相關系數反映各因素與響應值之間的真實關系，分析結果R2=0．978 4表明模型較好地反映了微波功率、提取時間、液固比等三個因素與黃酮提取率間的關系，即可以利用該模型分析和預測不同提取條件下總黃酮的提取率的變化。同時表明，一次項B、二次項A2、B2、C2對黃酮提取率影響極顯著;交互項AC、BC對黃酮提取率影響顯著。

表3 二次回歸模型的方差分析結果Tab．3 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

2．3．3 響應曲面結果的優(yōu)化

根據模型方程繪制響應曲面圖和等高線圖，分別考察微波功率、提取時間和液料比等三個因素對黃酮提取率的影響 (圖3～5)。各組圖分別直觀的反映了各因素及交互作用對總黃酮提取率的影響。

圖3 微波功率和提取時間對玉米須總黃酮提取率影響的響應面和等高線圖Fig．3 Response surface and contour plots showing the interactive effect of microwave power and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

等高線圖上，微波功率對提取率的影響曲線比較平緩，表明其對提取率的影響相對較小 (圖3);提取時間對提取率的影響比較顯著，呈現先升高后降低的趨勢。兩因素對提取率的影響并非直線關系，并且兩因素的交互作用不顯著，與方差分析結果一致。響應曲面圖開口向下，表明在實驗所選范圍內存在極大值。可確定的最佳水平范圍:微波功率為120～260 W。

圖4 微波功率和液固比總黃酮提取率影響的響應面和等高線圖Fig．4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of microwave power and liquid to sample ratio on the extraction rate of total flavonoids

微波功率和液固比對提取率的影響曲線均呈現先升高后降低的趨勢 (圖4)，表明二者影響都較為顯著，即二者交互作用顯著。在實驗所選范圍內存在極大值。因此可確定的最佳水平范圍:提取時間為8-13 min。

等高線上看出，液固比的影響曲線較提取時間的影響曲線較為平緩 (圖5)，表明提取時間對提取率的影響較液固比的影響更為顯著。在實驗范圍內存在極值?？纱_定的液固比水平范圍為:11～16 mL/g。

綜合圖3～5表明，因素對提取率的影響大小順序為:B(提取時間) ＞C(液固比) ＞A(微波功率);因素的交互作用對提取率的影響順序為:AC＞BC＞AB，與方差分析結果完全一致。

圖5 提取時間和液固比對總黃酮提取率影響的響應面圖Fig．5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of extraction time and liquid to sample ratio on the extraction rate of total flavonoids

2．3．4 最佳工藝條件的確定

對模型方差進行求導計算。得到因素的最優(yōu)水平分別為微波功率233．2 W，提取時間10．8 min，液固比14．1 mL/g，在該條件下玉米須中總黃酮的提取率為1．421%?？紤]到實際操作的情況，將微波功率調整為240 W、提取時間為11 min、液料比14 mL/g，在該條件下平行提取3次，最終得到玉米須總黃酮的實際提取率為1．401%，模型理論預測值為1．432%，偏差僅2．17%。

3 結論

本研究基于微波輔助法的提取優(yōu)點，以中國資源豐富的成熟期玉米須為研究對象，對陜產玉米須(成熟期)中總黃酮進行了微波輔助法提取，并采用響應曲面法進行了工藝優(yōu)化，結合實際提取條件，得到玉米須總黃酮的最優(yōu)提取條件，該工藝下均比文獻報道的提取方法總黃酮提取率高。為進一步開發(fā)中國資源豐富的玉米須資源提供了參考。

［1］周鴻立，張艷，張揚，等．玉米須的開發(fā)利用前景［J］．江蘇農業(yè)科學，2011，39(3):508-509．

［2］陳耀章，馬琴國．玉米須降糖、降壓、降脂、保肝作用研究［J］．中醫(yī)研究，2014，3:20-22．

［3］劉傳水，太志剛，李愛梅，等．云南產玉米須的化學成分研究［J］．天然產物研究與開發(fā)，2011(12):40-42．

［4］徐燕，鄒忠梅，梁敬鈺．玉米須的化學成分［J］．中國天然藥物，2008(5):237-238．

［5］周宗義．玉米須藥理作用的研究近況［J］．臨床軍醫(yī)雜志，2012(6):1562-1565．

［6］紀麗蓮．玉米須的食療價值與開發(fā)［J］．中國野生植物資源，1997，16(3):24-25．

［7］石國榮，饒力群．微波萃取技術在天然產物活性成分提取中的研究進展［J］．化學與生物工程，2003(6):4-6．

［8］白建華，趙昀，郭曉霞．微波輔助提取玉米須黃酮工藝研究［J］．中國農學通報，2010，26(2):71-73．

［9］張艷，劉杰，周靜姝．超聲波加酶法提取玉米須黃酮的工藝研究［J］．西北藥學雜志，2012，4(2):98-100．

［10］李俠，馬艷梅，孫慧娟，等．超聲波-雙酶法協同提取玉米須黃酮工藝的優(yōu)化［J］．西北農林科技大學學報(自然科學版)，2014(4):223-227．

［11］周鴻立，董衛(wèi)權，肖振晶，等．微波法提取玉米須總黃酮的工藝研究(英文)［J］．時珍國醫(yī)國藥，2011，22(2):483-486．