鄭書國， 趙夢秋， 吳元潔， 任尤楠

（1.皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)教研室，安徽 合肥230038）

丹蛭降糖膠囊對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡和胰島素分泌的影響

鄭書國1， 趙夢秋1， 吳元潔2*， 任尤楠1

（1.皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)教研室，安徽 合肥230038）

糖尿病是由于絕對(duì)或相對(duì)胰島素分泌不足引起的以高血糖為主要特征的代謝性疾病。長期高血糖一方面可引起各種急慢性并發(fā)癥，另一方面又發(fā)出胰島素需求信號(hào)，短期內(nèi)可使胰島B細(xì)胞代償性分泌更多胰島素，長期則引起B(yǎng)細(xì)胞功能衰竭，胰島素分泌進(jìn)一步減少，血糖進(jìn)一步升高，形成惡性循環(huán)。胰島B細(xì)胞數(shù)量減少及功能缺陷是胰島功能衰竭的主要原因，而高血糖引起的B細(xì)胞凋亡則是導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少的主要機(jī)制［1］。臨床資料顯示，由于存在胰島素抵抗和胰島功能缺陷，加之飲食控制不佳、用藥不當(dāng)?shù)仍?，糖尿病患者常出現(xiàn)明顯血糖波動(dòng)，表現(xiàn)為餐后高血糖及降糖藥物引發(fā)的低血糖［2］。大量研究表明，波動(dòng)高血糖較持續(xù)性高血糖更易誘導(dǎo)胰島B細(xì)胞凋亡，加重胰島功能損傷［3］，且血糖波動(dòng)水平可作為評(píng)價(jià)糖尿病患者血糖控制情況和預(yù)測并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的可靠指標(biāo)［4］。因此，抑制波動(dòng)血糖誘導(dǎo)的胰島功能損傷和B細(xì)胞凋亡，是預(yù)防和減輕糖尿病慢性并發(fā)癥的重要措施。

丹蛭降糖膠囊由丹皮、太子參、生地黃、水蛭等組成，具有降低血糖、改善胰島B細(xì)胞功能之效，臨床主要用于治療2型糖尿病，但對(duì)其改善糖尿病確切機(jī)制目前仍未明確。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)的大鼠胰島素瘤細(xì)胞株 （INS-1），采用血清藥理學(xué)方法觀察丹蛭降糖膠囊對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡和胰島素分泌功能的影響，以進(jìn)一步探討其改善糖尿病作用機(jī)制，為臨床用于防治糖尿病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品與試劑 Wistar大鼠購于南京青龍山動(dòng)物繁殖場 （合格證號(hào)SCXK2009-0001）；丹蛭降糖膠囊由安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；INS-1細(xì)胞株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；抗胰十二指腸同源盒基因-1（PDX-1）抗體 （Abcam公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博公司）；β-actin抗體、二抗、胰酶、ECL試劑、超氧化物歧化酶 （SOD）、總抗氧化能力 （TAC）檢測試劑盒等 （碧云天生物技術(shù)研究所）；其它試劑均為分析純。

1.2 含藥血清制備 Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。除對(duì)照組外，其余2組每天灌胃給予高、低劑量丹蛭降糖膠囊 （6.4 g/kg、3.2 g/kg），分2次給藥，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，無菌條件下分離血清，56℃水浴滅活30 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（11.1 mmol/L葡萄糖，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，1 mmol/L丙酮酸鈉，50μmol/Lβ-巰基乙醇），37℃、5%CO2、飽和空氣濕度培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至近融合時(shí)，0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.4 INS-1細(xì)胞活性檢測 生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后按2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、波動(dòng)高糖組、空白血清組和丹蛭降糖膠囊高、低劑量組。丹蛭降糖膠囊高、低劑量組分別加入相應(yīng)含藥血清 （終濃度10%），空白血清組加入對(duì)照血清 （終濃度10%），孵育24 h。除正常對(duì)照組外，其余各組均加入高濃度葡萄糖（終濃度33.3 mmol/L），孵育12 h，更換為普通濃度葡萄糖 （11.1 mmol/L）［5］，持續(xù)12 h，連續(xù)3 d，MTT法測定細(xì)胞活性。

1.5 INS-1細(xì)胞胰島素釋放試驗(yàn)［6］生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后按2×105個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及藥物處理同上。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入含5.6 mmol/L葡萄糖的Hanks液預(yù)孵30 min，再分別更換為含5.6 mmol/L及16.7 mmol/L葡萄糖的Hanks液，37℃各孵育1 h，分別收集細(xì)胞上清液，ELISA法測定胰島素含量。

1.6 PDX-1蛋白表達(dá)檢測 PDX-1蛋白表達(dá)采用Western blot法檢測。生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及處理同上。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入RIPA裂解液冰浴裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液混勻后沸水浴變性5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入抗PDX-1和β-actin抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色，X光膠片曝光顯影，凝膠圖像分析儀分析條帶光密度，結(jié)果以PDX-1/β-actin表示。

1.7 INS-1細(xì)胞凋亡檢測 生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至近融合時(shí)按 “1.4”項(xiàng)下分組及藥物處理。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，400μL結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC染色液，混勻后4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色液混勻，4℃避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平 （激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）。

1.8 INS-1細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）檢測 生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及處理同上。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后胰酶消化收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于DCFH-DA溶液中，37℃孵育20 min，PBS洗滌細(xì)胞，重懸后流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度 （激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm），以熒光陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.9 INS-1細(xì)胞抗氧化能力檢測 生長近融合的INS-1細(xì)胞胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組及處理同上。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后收集細(xì)胞，超聲細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明測定細(xì)胞總抗氧化能力（TAC）和SOD活性，BCA法測定蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞活性的影響 由圖1可見，暴露于波動(dòng)高糖72 h后，INS-1細(xì)胞活性明顯受損 （P＜0.01），而含丹蛭降糖膠囊血清可顯著提高細(xì)胞活性 （P＜0.01），對(duì)照血清對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，提示丹蛭降糖膠囊可有效改善波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷。

圖1 丹蛭降糖膠囊對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞活性損傷的影響（，n=8）Fig.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on the viability of INS-1 cells exposed to interm ittent high glucose（，n=8）

2.2 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響 由圖2可見，基礎(chǔ)狀態(tài)下（5.6 mmol/L葡萄糖）INS-1細(xì)胞僅有低水平胰島素分泌，而在加入高濃度葡萄糖（16.7 mmol/L）刺激后，胰島素分泌量明顯增加。當(dāng)INS-1細(xì)胞暴露于波動(dòng)高糖環(huán)境72 h后，基礎(chǔ)狀態(tài)和高濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌水平均顯著下降 （P＜0.01），說明波動(dòng)高糖明顯損傷了INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能。與含丹蛭降糖膠囊血清預(yù)孵后，INS-1細(xì)胞胰島素分泌能力明顯改善 （P＜0.05或P＜0.01），而對(duì)照血清對(duì)胰島素分泌無明顯影響，提示丹蛭降糖膠囊可有效減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能損傷。

圖2 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響（，n=6）Fig.2 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on insulin secretion in INS-1 cells（，n=6）

2.3 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響 由圖3可見，正常情況下，INS-1細(xì)胞凋亡率極低，而暴露于波動(dòng)高糖環(huán)境72 h后，INS-1細(xì)胞凋亡率明顯增加 （P＜0.01），表現(xiàn)為凋亡早期和凋亡晚期或壞死細(xì)胞均顯著增多。與含丹蛭降糖膠囊血清預(yù)孵24 h后再暴露于波動(dòng)高糖，細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），而對(duì)照血清對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡無明顯影響，提示丹蛭降糖膠囊可有效抑制波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。

圖3 丹蛭降糖膠囊對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on INS-1 cell apoptosis induced by interm ittent high glucose

2.4 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞PDX-1蛋白表達(dá)的影響 由圖4可見，暴露于波動(dòng)高糖72 h后，INS-1細(xì)胞PDX-1表達(dá)水平明顯下降，而與丹蛭降糖降囊含藥血清預(yù)孵能明顯增加PDX-1蛋白表達(dá)水平，這一作用與丹蛭降糖降囊增加INS-1細(xì)胞胰島素分泌和抑制細(xì)胞凋亡作用一致，提示丹蛭降糖降囊對(duì)INS-1細(xì)胞的保護(hù)作用與上調(diào)PDX-1蛋白表達(dá)有關(guān)。

2.5 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

由圖5可見，正常情況下INS-1細(xì)胞熒光陽性率及平均熒光強(qiáng)度均較低，而暴露于波動(dòng)高糖環(huán)境72 h后，二者均顯著升高 （P＜0.01），提示波動(dòng)高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高。與含丹蛭降糖膠囊血清預(yù)孵24 h再暴露于波動(dòng)高糖，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分率均顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），而對(duì)照血清對(duì)二者均無明顯影響，提示丹蛭降糖膠囊可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.6 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞抗氧化能力的影響 由表1可見，暴露于波動(dòng)高糖72 h后，INS-1細(xì)胞內(nèi)SOD活性和總抗氧化能力均明顯下降 （P＜ 0.01），這一結(jié)果與波動(dòng)高糖孵育后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高一致。與丹蛭降糖膠囊預(yù)孵后，細(xì)胞總抗氧化能力和SOD活性均明顯升高，提示丹蛭降糖膠囊可顯著提高INS-1細(xì)胞抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

圖4 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞PDX-1蛋白表達(dá)的影響（，n=4）Fig.4 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on PDX-1 expression in INS-1 cells（，n=4）

圖5 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（，n=4）Fig.5 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on intracellular ROS in INS-1 cells（，n=4）

表1 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞TAC和SOD活性的影響（，n=6）Tab.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on TAC and SOD activity in INS-1 cells（，n=6）

表1 丹蛭降糖膠囊對(duì)INS-1細(xì)胞TAC和SOD活性的影響（，n=6）Tab.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on TAC and SOD activity in INS-1 cells（，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與波動(dòng)高糖組比較，##P＜0.01

組別 SOD/（U/mg prot） TAC/（mmol/mg prot）正常對(duì)照組1.42±0.16 1.12±0.14波動(dòng)高糖組 0.61±0.08** 0.43±0.07**空白血清組 0.63±0.09** 0.47±0.06**丹蛭降糖高 1.14±0.18## 0.98±0.14##丹蛭降糖低 0.97±0.15## 0.82±0.10##

3 討論

高血糖是糖尿病最主要臨床特征之一，長期高血糖可加重胰島素抵抗和胰島B細(xì)胞損傷，使葡萄糖刺激的胰島素分泌功能進(jìn)一步受損，血糖水平進(jìn)一步升高，此即葡萄糖毒性作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于飲食控制不佳、用藥方案不當(dāng)、治療依從性差等多方面原因，糖尿病患者常在血糖總體水平明顯升高的基礎(chǔ)上出現(xiàn)血糖波動(dòng)性增大，也稱為血糖漂移［7］。相對(duì)于持續(xù)高血糖，波動(dòng)血糖更易引起各種嚴(yán)重并發(fā)癥，加重胰島B細(xì)胞損傷，且波動(dòng)性越大，慢性并發(fā)癥發(fā)生率越高、預(yù)后越差［8］。因此，有效控制血糖波動(dòng)或減輕波動(dòng)血糖所致的胰島B細(xì)胞損傷，是預(yù)防糖尿病并發(fā)癥、改善糖尿病預(yù)后的重要措施之一。本研究采用血清藥理學(xué)方法，觀察了丹蛭降糖降囊對(duì)INS-1細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，暴露于波動(dòng)高糖72 h后，INS-1細(xì)胞活性明顯降低，基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌能力明顯下降，而與丹蛭降糖膠囊含藥血清預(yù)孵后，INS-1細(xì)胞活性明顯提高，胰島素分泌功能顯著改善，提示丹蛭降糖膠囊可有效減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷，這可能是丹蛭降糖降囊降低血糖、改善糖尿病的主要機(jī)制之一。

大量研究表明，高血糖可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)，增加機(jī)體ROS產(chǎn)生，而波動(dòng)性高血糖較持續(xù)性高血糖更易誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)［9］，降低血糖波動(dòng)水平可明顯降低2型糖尿病患者機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)［10］。由于胰島B細(xì)胞表達(dá)的 （SOD）等抗氧化酶水平相對(duì)較低，故胰島B細(xì)胞抗氧化能力較弱，對(duì)ROS介導(dǎo)的損傷極為敏感［11］。大量ROS既可直接引起胰島B細(xì)胞氧化損傷，也可通過影響胰島素合成和分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接損傷胰島B細(xì)胞。胰十二指腸同源盒基因-1（PDX-1）是在胰島B細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是胰島素基因表達(dá)和胰島素釋放最主要的激活因子之一。ROS可減少PDX-1 mRNA表達(dá)，降低PDX-1與胰島素啟動(dòng)子結(jié)合活性，下調(diào)胰島素mRNA轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致胰島素合成和釋放減少［12-13］。此外，PDX-1可促進(jìn)胰島B細(xì)胞增值，抑制其凋亡，提示ROS誘導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡與減少PDX-1生成有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，暴露于波動(dòng)高糖72 h后，INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加，PDX-1蛋白表達(dá)水平顯著下降，胰島素釋放明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著升高，而與丹蛭降糖降囊含藥血清預(yù)孵后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著下降，PDX-1表達(dá)和胰島素釋放增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低。由于對(duì)照血清對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的上述變化均無明顯影響，提示丹蛭降糖降囊可能通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、上調(diào)PDX-1蛋白表達(dá)而發(fā)揮胰島B細(xì)胞保護(hù)作用。

前期研究表明，丹蛭降糖降囊各組成藥物均有顯著抗氧化活性，其復(fù)方制劑能明顯提高胰腺組織SOD等抗氧化酶活性，減輕胰腺組織氧化損傷［15］。本研究結(jié)果也顯示，丹蛭降糖降囊能顯著提高INS-1細(xì)胞SOD活性和總抗氧化能力，提示丹蛭降糖降囊可通過提高INS-1細(xì)胞抗氧化能力而減少細(xì)胞內(nèi)ROS水平。此外，丹蛭降糖降囊可顯著降低NADPH氧化酶p22phox表達(dá)水平［16］，而后者是細(xì)胞內(nèi)源性ROS的主要來源，高血糖尤其是波動(dòng)高糖可通過激活NADPH氧化酶而增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平［17］。這些結(jié)果提示，丹蛭膠囊既可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性而發(fā)揮抗氧化作用，也可通過抑制ROS產(chǎn)生而保護(hù)胰島B細(xì)胞免受氧化損傷。

綜上所述，丹蛭降糖降囊可有效減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷和凋亡，改善胰島素分泌功能，其機(jī)制與增強(qiáng)INS-1細(xì)胞抗氧化能力、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而上調(diào)PDX-1蛋白表達(dá)有關(guān)，這一作用可能是丹蛭降糖降囊降低血糖、改善糖尿病主要機(jī)制之一。

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摘要：目的 探討丹蛭降糖膠囊 （丹皮、太子參、生地黃、水蛭等）對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島素瘤細(xì)胞 （INS-1）凋亡和胰島素分泌功能的影響，并探討其可能機(jī)制。方法 INS-1細(xì)胞與丹蛭降糖膠囊含藥血清和對(duì)照血清預(yù)孵24 h后暴露于波動(dòng)高糖（11.1 mmol/L 12 h，33.3 mmol/L 12 h）72 h。MTT法測定INS-1細(xì)胞活性，ELISA法測定胰島素釋放水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)活性氧 （ROS）水平，Western blot法檢測胰十二指腸同源盒基因-1（PDX-1）蛋白表達(dá)水平，比色法測定細(xì)胞總抗氧化能力 （TAC）和超氧化物歧化酶 （SOD）活性。結(jié)果 含丹蛭降糖膠囊血清可明顯減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷、凋亡和胰島素分泌功能障礙 （P＜0.05或P＜0.01），上調(diào)PDX-1蛋白表達(dá)水平 （P＜0.01），并能顯著提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性和總抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)論 丹蛭降糖膠囊可有效減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷和凋亡，改善胰島素分泌功能，其機(jī)制與提高細(xì)胞抗氧化能力、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而上調(diào)PDX-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。
關(guān)鍵詞：丹蛭降糖膠囊；糖尿?。徊▌?dòng)高糖；INS-1細(xì)胞；活性氧
中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1528（2015）04-0722-07
doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.007

Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on insulin secretion capacity and apoptosis of INS-1 cell exposed to interm ittent high glucose

ZHENG Shu-guo1， ZHAO Meng-qiu1， WU Yuan-jie2， REN You-nan1
（1.Departmentof Pharmacology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China；2.Departmentof Basic Theory of TraditionalChineseMedicine，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei230038，China）

AIMTo explore the effect of Danzhi Jiangtang Capsules（Moutan Cortex，Pseudostellariae Radix，Rehmanniae Radix，Hirudo，etc）on insulin secretion capacity and apoptosis of INS-1 cells exposed to intermittent high glucose.METHODSFollowing pre-incubation with Danzhi Jiangtang Capsules containing serum and control serum for24 h，INS-1 cellswere exposed to intermittenthigh glucose（IHG，11.1mmol/L 12 h，33.3mmol/L 12 h）for72 h.Cell viability was determined by MTT assay and insulin secretion capacity was evaluated by ELISA. Cell apoptosis and intracellular ROSwere determined by flow cytometry analysis.Protein expression of pancreatic and duodenal homeobox-1（PDX-1）was assayed byWestern-blot.Total antioxidant capacity and SOD activity were assessed by colorimetric assay using commercially available kits.RESULTSPretreatment with Danzhi Jiangtang Capsules containing serum significantly improved IHG-induced INS-1 cell injury and insulin secretion dysfunction（P＜0.05 or P＜0.01），suppressed IHG-induced cell apoptosis，and up-regulated the expression of PDX-1 protein（P＜0.05 or P＜0.01）.Pre-incubation with Danzhi Jiangtang Capsules led to a significantenhancementof antioxidant capacity and reduction of intracellular ROS（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONDanzhi Jiangtang Capsules is capable of suppressing IHG-induced INS-1 cell apoptosis and improving its insulin secretion ca-pacity，whichmightbe attributed to the enhancementof antioxidant capacity and subsequentup-regulation of PDX-1 expression.

Danzhi Jiangtang Capsules；diabetes；intermittent high glucose；INS-1 cells；reactive oxygen species

2014-10-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助 （81102626H2716）

鄭書國（1967—），男，博士，副教授，從事藥理學(xué)教學(xué)、研究工作。E-mail：zhengsg2000@163.com

*通信作者：吳元潔 （1973—），女，教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)研究。Tel：15155906032，E-mail：anhuiwuyuanjie@126.com