鄭會(huì)明+翟娜娜+毛怡玲+鐘增濤

摘要：通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)研究紫云英根瘤菌不同菌株間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，以紫云英寧波大橋品系為宿主植物，7株分離自不同生境紫云英根部瘤體內(nèi)的菌株與中慢生華癸根瘤菌7653R為研究對(duì)象，采用單獨(dú)接種、與7653R菌株1∶1混合接種方式，在30d時(shí)采樣，統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫云英根瘤菌2號(hào)菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力與7653R相當(dāng)，其他菌株的競(jìng)爭(zhēng)性都不同程度地弱于7653R，尤其是1號(hào)菌株的定殖能力最弱，僅是7653R占瘤率的9%。在同時(shí)含有2種根瘤菌的瘤體內(nèi)，7653R和競(jìng)爭(zhēng)菌株的數(shù)量比例相近。不同生境根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力存在差異，試驗(yàn)同時(shí)獲得了1株與經(jīng)典菌株7653R競(jìng)爭(zhēng)能力相當(dāng)?shù)淖显朴⒏鼍辍?/p>

關(guān)鍵詞：紫云英根瘤菌；7653R；競(jìng)爭(zhēng)性；占瘤率

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0403-03

豆科植物的固氮作用是在根瘤菌的參與下完成的，其過(guò)程包括根瘤菌吸附侵染豆科植物根毛，引起根毛卷曲形成侵入線，最終引起植物形成根瘤，根瘤菌在根瘤內(nèi)部進(jìn)行生物固氮并將其產(chǎn)物輸送給植物。該共生固氮體系在促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、減少化學(xué)氮肥施用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面都具有極其重要的意義，因而研究、開發(fā)、利用這一共生固氮體系具有重大的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值[1]。大豆、豌豆、苜蓿、三葉草、菜豆等豆科植物可以作為動(dòng)物以及人類的食物氮源；紫云英可作為田間作物的氮肥提高作物產(chǎn)量，也可作為綠肥在貧瘠的土壤中生長(zhǎng)，從而提升土壤質(zhì)量。我國(guó)已在浙江、福建、江蘇等地廣泛種植紫云英、苜蓿、三葉草等豆科固氮植物，作為綠肥或者牲畜食料。

實(shí)踐證明，接種與不接種根瘤菌關(guān)系到綠肥植物收獲量的多少，但由于人工接種的根瘤菌劑與土著根瘤菌之間存在競(jìng)爭(zhēng)性，往往不能達(dá)到預(yù)期的接種效果[2]，也阻礙了固氮菌株應(yīng)有效用的發(fā)揮。近年來(lái)在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤機(jī)制和根瘤菌寄主特異性方面的研究取得了許多進(jìn)展，對(duì)根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤相關(guān)基因及豆科植物的寄主專一性結(jié)瘤相關(guān)基因均有了一定的認(rèn)識(shí)。其中根瘤菌本身的基因型對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力具有重要影響，目前已經(jīng)報(bào)道了根瘤菌的運(yùn)動(dòng)性、趨化性、細(xì)菌素的產(chǎn)生[3]、生長(zhǎng)繁殖速度、細(xì)胞表面特征、結(jié)瘤相關(guān)基因[4]，如大豆慢生根瘤菌中的nfeC基因[5]、中華苜蓿根瘤菌中的nifA基因等[6]，它們?cè)诮Y(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)力方面發(fā)揮了重要的作用。

影響競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的因素復(fù)雜多樣，解決方案也很多，但篩選使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力高的根瘤菌和選育抑制土著根瘤菌結(jié)瘤的植物品種是最佳的途徑。陳華癸等最先在我國(guó)分離獲得紫云英根部有效結(jié)瘤的菌株中慢生華癸根瘤菌[7]，目前在田間試驗(yàn)中被廣泛接種應(yīng)用的是具有良好結(jié)瘤固氮能力的7653R，該菌株同時(shí)還作為中慢生紫云英根瘤菌的典型菌株，其基因組已由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)初步完成測(cè)定。本研究從不同生境環(huán)境紫云英的根部瘤體中分離了9株紫云英根瘤菌，比較了其在不同品種紫云英根部結(jié)瘤的能力，同時(shí)還研究了其與典型菌株7653R共同接種時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，初步獲得了1株與7653R結(jié)瘤能力相當(dāng)?shù)木?，為后續(xù)大田的接種使用提供了材料，同時(shí)也為后續(xù)研究競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力相關(guān)的遺傳學(xué)分析提供了新的試驗(yàn)對(duì)象。

1材料與方法

1.1供試菌株與材料

試驗(yàn)所用菌株為中慢生華癸根瘤菌7653R，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)。其他9株紫云英根瘤菌分離自不同生境紫云英根部瘤體內(nèi)。根瘤菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為TY培養(yǎng)基[8]，所用抗生素濃度為利福平（Rif）20μg/mL、鏈霉素（Str）100μg/mL。

紫云英種子閩紫5號(hào)由福建省土壤肥料所提供，粵肥1號(hào)、信陽(yáng)種、弋江種、寧波大橋和閩紫6號(hào)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；蛭石購(gòu)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)芳華園藝中心。

1.2種子表面消毒與催芽

將紫云英種子放入無(wú)菌三角瓶中，無(wú)菌水清洗數(shù)次以洗去種子表面的塵土；75%乙醇處理5min，無(wú)菌水洗3次；5%NaClO處理3min，無(wú)菌水洗10次以洗凈種子表面殘留試劑；加入適量的無(wú)菌水浸泡3h使其充分吸水膨脹，隨后分裝至平板中，使種子單層均勻地鋪開；將種子于22℃黑暗中倒置催芽（在平板蓋底部灑些無(wú)菌水以保持濕潤(rùn)的催芽環(huán)境），約24h后種子露白，即可種植。

1.3確定紫云英植株品系及菌株

分別以粵肥1號(hào)、信陽(yáng)種、弋江種、寧波大橋、閩紫6號(hào)和閩紫5號(hào)共6個(gè)品系紫云英種子作為宿主植物，活化中慢生紫云英根瘤菌菌株至D600nm約為2.0，浸泡已發(fā)芽紫云英種子20min，種植入一次性杯子盛裝的無(wú)菌蛭石中，設(shè)置溫室溫度為白天16℃、12h，黑夜22℃、12h，適時(shí)適量澆灌無(wú)菌水和無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。每組種植6盆，每盆5株苗，待第1張真葉長(zhǎng)出后，間苗，留下生長(zhǎng)狀態(tài)趨于一致的20株苗；同時(shí)接種無(wú)菌水處理作為空白對(duì)照。分別在15、30d時(shí)觀察結(jié)瘤情況，以結(jié)瘤情況確定競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)的供試菌株和紫云英種子品系。

1.4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)

TY培養(yǎng)基中活化根瘤菌細(xì)胞密度至D600nm約2.0，將7653RStr抗性突變株菌液與其他根瘤菌Rif抗性突變株培養(yǎng)菌液等體積（4mL∶4mL）混合，振蕩混勻，浸泡紫云英種子20min，種植，以單獨(dú)接種處理組作為對(duì)照；以接種無(wú)菌水處理作為空白對(duì)照。每組處理設(shè)置20株紫云英重復(fù)。

1.5根瘤數(shù)量、根瘤重量統(tǒng)計(jì)及菌體分離

小心拆盆，輕輕抖落根部蛭石，剪取每顆根瘤，記錄瘤數(shù)、瘤質(zhì)量。將單個(gè)根瘤瘤體置于1.6%NaClO下處理1min進(jìn)行表面消毒殺菌，水洗4次，去除殘留藥物。將表面消毒后的單個(gè)根瘤置于1.5mL離心管中，搗碎后用500μL無(wú)菌水懸浮，振蕩混勻后，取100μL該菌液到900μL無(wú)菌水中，依次進(jìn)行梯度稀釋至10-4。對(duì)于單獨(dú)接種根瘤菌的紫云英植株，每個(gè)梯度各取10μL點(diǎn)樣于TY空白板，待長(zhǎng)出單菌落后，計(jì)數(shù)；對(duì)于混合接種根瘤菌的紫云英植株根瘤，每個(gè)梯度各取10μL點(diǎn)樣于分別含有Str100μg/mL、Rif20μg/mL的TY平板上，待長(zhǎng)出單菌落后，計(jì)數(shù)。endprint

2結(jié)果與分析

2.1確定紫云英植物品系及根瘤菌菌株種類

從不同生境紫云英根部瘤體分離到了9株根瘤菌，分別單獨(dú)接種至6個(gè)品系的紫云英種子，在15、30d時(shí)觀察結(jié)瘤情況，以7653R菌株作為陽(yáng)性對(duì)照菌。如表1所示，從根瘤菌結(jié)瘤專一性看，8、9號(hào)菌株與紫云英共生結(jié)瘤的專一性很強(qiáng)，在15d時(shí)只與信陽(yáng)種共生結(jié)瘤；而1～7號(hào)菌株對(duì)宿主的專一性較低。從紫云英植物宿主的專一性看，信陽(yáng)種、弋江種和寧波大橋種對(duì)菌種的專一性較其他品系要低：15d時(shí)，信陽(yáng)種可以與所有測(cè)試菌株共生結(jié)瘤；30d時(shí)，弋江種、寧波大橋種均能和所有菌株共生結(jié)瘤。

2.2紫云英根瘤菌分離菌株與其Rif抗性菌株結(jié)瘤能力的鑒定

在以上結(jié)瘤試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用可以與所有測(cè)試菌株有效結(jié)瘤的寧波大橋種作為后續(xù)紫云英根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)的宿主植物，1～7號(hào)菌株作為根瘤菌侵染對(duì)象。為了區(qū)分瘤體內(nèi)紫云英根瘤菌的種類，需要選擇合適的篩選標(biāo)簽，抗生素是被廣泛應(yīng)用的標(biāo)簽之一[9]。本研究篩選獲得了1～7號(hào)7株紫云英根瘤菌的Rif自發(fā)突變抗性株Z1-Z7，檢測(cè)了Rif抗性的產(chǎn)生是否會(huì)影響原有根瘤菌的結(jié)瘤能力。

分別將野生型菌株與Rif抗性株單獨(dú)接種到紫云英植株，結(jié)果如圖1所示，野生型和Rif抗性突變株根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量均無(wú)顯著差異，因此后續(xù)可以用Rif抗性突變株代表野生型菌株進(jìn)行與7653R間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)。

[FK（W20][TPDHM1.tif][FK）]

2.3紫云英分離菌株與7653R間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤

在實(shí)踐中接種根瘤菌劑到土壤中時(shí)，根瘤菌劑與土著菌的濃度未知、二者之間的數(shù)量比值也不確定。在本競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)中，設(shè)置了2種接種液濃度，為了更接近于實(shí)際菌劑接種中的細(xì)胞密度，分別設(shè)置了1.0×106CFU/mL和1.0×107CFU/mL2種接種液濃度，浸泡已輕微發(fā)芽的紫云英種子，各20個(gè)重復(fù)。

在接種后30d時(shí)，統(tǒng)計(jì)各處理的根瘤菌總數(shù)和結(jié)瘤數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)瘤數(shù)量上，1、2、5、7號(hào)菌株與7653R混合接種處理后，根瘤數(shù)量比單獨(dú)接種處理組時(shí)稍少（圖2），3號(hào)菌株與7653R混合接種后結(jié)瘤數(shù)量比單獨(dú)接種時(shí)稍多。在瘤體質(zhì)量上，僅4號(hào)菌株混合接種的瘤體質(zhì)量低于單獨(dú)接種菌株。這說(shuō)明菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)可能會(huì)影響植株的結(jié)瘤情況，但影響都不顯著。

在2種不同根瘤菌共同接種過(guò)程中，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)瘤主要是通過(guò)比較瘤體內(nèi)根瘤菌的數(shù)量比率，即占瘤率來(lái)衡量的[10]。將7653R和1～7號(hào)菌株分別1∶1混合接種至紫云英根部，30d后，統(tǒng)計(jì)每處理中根瘤菌的占瘤率情況。如圖3所示，在所有類型的混合接種處理中，86.96%～94.29%的瘤體都是單個(gè)根瘤菌侵染形成，而2種不同根瘤菌共同侵占同一瘤體的比率只有5.71%～13.04%，該結(jié)果與Gage等的研究結(jié)果

一致[11]。在所有的共同接種試驗(yàn)中，多數(shù)菌株（1、3、4、5、6、7號(hào)菌株）的競(jìng)爭(zhēng)性都不同程度地弱于7653R，占瘤率僅是7653R的43%～62%，尤其是1號(hào)菌株的定殖能力最弱，約是7653R占瘤率的9%。該結(jié)果顯示出了傳統(tǒng)大田應(yīng)用菌株7653R良好的競(jìng)爭(zhēng)能力，但同時(shí)也表明，2號(hào)菌株在瘤體中的占瘤率為48.77%，與7653R的競(jìng)爭(zhēng)能力相當(dāng)（42.44%），這顯示了不同紫云英根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)能力的差異。

根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)能力的比例還可以通過(guò)考察2種根瘤菌共同占據(jù)的瘤體內(nèi)根瘤菌的數(shù)量比例。將圖3中2種根瘤菌共同占據(jù)的瘤體搗碎后，進(jìn)行梯度稀釋計(jì)數(shù)，據(jù)抗性計(jì)算其中2種不同根瘤菌確切的細(xì)菌數(shù)量，計(jì)算數(shù)量比值。如圖4所示，在7653R與紫云英分離菌株共同占據(jù)的瘤體內(nèi)，7653R與不同根瘤菌的數(shù)量比均接近1，其數(shù)量相當(dāng)。

3討論

將紫云英根瘤菌經(jīng)典菌株7653R與分離自不同生境的9株紫云英根瘤菌菌株，分別單獨(dú)接種于閩紫1號(hào)、閩紫6號(hào)、粵肥2號(hào)、弋江種、信陽(yáng)種、閩紫5號(hào)、寧波大橋共6個(gè)品系的紫云英植株，確定結(jié)瘤專一性較低的7株紫云英根瘤菌和寧波大橋種子作為后續(xù)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的研究菌株。

在7653R和1～7號(hào)菌株間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單接處理組之間、混接處理組之間在根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量、結(jié)瘤時(shí)間方面均無(wú)顯著差異。在統(tǒng)計(jì)了不同根瘤菌的占瘤率后，確定了2號(hào)菌株競(jìng)爭(zhēng)性較強(qiáng)，與7653R占瘤率相當(dāng)，其他檢測(cè)菌株則都低于7653R，尤其是1號(hào)菌株，其占瘤率僅是同時(shí)接種的7653R占瘤率的9%。在同時(shí)含有2種根瘤菌的根瘤內(nèi)，7653R和混合接種的紫云英根瘤菌菌數(shù)比值多在0.1～10，且多集中在1附近，說(shuō)明二者在同一根瘤內(nèi)部的定殖能力相近。

根瘤菌與植物的共生固氮是二者之間不斷發(fā)生信號(hào)交流互作的過(guò)程，該過(guò)程還包括不同根瘤菌之間的競(jìng)爭(zhēng)，人工接種的根瘤菌菌劑要取得良好的施肥效果，首先需要具有一定的與土壤中原有根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)的能力。已有的研究結(jié)果表明，影響根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的因素主要是根瘤菌與宿主植物的遺傳因素，也和土壤的生態(tài)環(huán)境相關(guān)。將同一種根瘤菌接種到不同基因型的植株結(jié)瘤，其結(jié)瘤能力表現(xiàn)不同，即根瘤菌對(duì)宿主植物基因型有一定的依賴性，如有研究表明大豆的隱性基因rjl能抑制許多大豆慢生根瘤菌的結(jié)瘤[12]。根瘤菌本身基因型對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力也有重要影響，一些根瘤菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可抑制其他對(duì)該細(xì)菌素敏感的根瘤菌，如可以產(chǎn)生三葉草素的豌豆根瘤菌三葉草型T24菌株，可抑制對(duì)三葉草素敏感的菌株的結(jié)瘤，但三葉草素抗性菌株的結(jié)瘤則不受其抑制。田間試驗(yàn)也證實(shí)，產(chǎn)生三葉草素的工程菌株比不產(chǎn)三葉草素菌株在占瘤率方面至少高20%，且在產(chǎn)量方面，也不遜于接種不產(chǎn)三葉草素的作物[3]。

本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)菌劑接種有一定的理論指導(dǎo)意義。將競(jìng)爭(zhēng)能力與7653R相當(dāng)?shù)?號(hào)菌株制成菌劑可以接種到紫云英根部，最大限度地排斥土著根瘤菌，增強(qiáng)接種效果，以充分發(fā)揮生物固氮的作用，減少化肥的施用。在后續(xù)研究中，還可以將根瘤菌接種于不同品系的紫云英，考察不同的根瘤菌與何種品系紫云英植株共生結(jié)瘤能力最強(qiáng)，從而有針對(duì)性地進(jìn)行根瘤菌菌劑的定向接種，提高接種效率，用最低的成本改善土壤環(huán)境或得到更多的鮮草量。endprint

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