牛明芬+武肖媛+于海嬌+梁文娟+王思博

摘要：通過“富集—初篩—復(fù)篩”流程，篩選出4株對纖維素有強(qiáng)降解能力的菌株，分別標(biāo)記為TG1、HN1、HP2、P3。對4株菌的纖維素酶活性進(jìn)行了定量測定；通過生理生化試驗(yàn)，初步鑒定TG1為放線菌，HP2為地衣芽孢桿菌，P3、HN1為枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；分離；纖維素酶活；鑒定

中圖分類號：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0393-02

隨著我國養(yǎng)牛行業(yè)的發(fā)展，牛存欄量也逐年增加。根據(jù)調(diào)查顯示，2009年我國奶牛存欄量達(dá)1260萬頭，2010年的存欄量達(dá)1420.1萬頭。存欄量為200～2000頭的肉奶?；兀刻炜僧a(chǎn)生的牛糞在5～50t[1]。未經(jīng)處理的牛糞隨意堆放，不僅造成了人們的視覺污染，而且對大氣、土壤、水造成了很大污染。相較于其他畜禽糞便，牛糞含纖維素、半纖維素等有機(jī)難降解物質(zhì)比較多，自然降解時間長[1-2]。

針對牛糞中含纖維素較多且自然降解時間長的特點(diǎn)，本試驗(yàn)將降解纖維素能力強(qiáng)的菌株分離篩選出來，以期用于后續(xù)的牛糞堆肥試驗(yàn)縮短牛糞堆肥發(fā)酵時間。

1材料與方法

1.1樣品采集

土壤樣品采自沈陽建筑大學(xué)樹林落葉堆積處；牛糞樣品采自本溪木蘭花牛場的鮮牛糞、腐熟牛糞、堆積1年的牛糞。落葉堆積處取樣時，在土層5～10cm處進(jìn)行采樣，平面采樣用“之”字形取樣，剖面取樣采用定點(diǎn)取土[3]。

1.2培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏合成一號、剛果紅纖維素鈉篩選培養(yǎng)基、濾紙條液體培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體發(fā)酵培養(yǎng)基[3]、豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1纖維素降解菌的富集分別稱取5g不同的采集樣品，置于45mL裝有玻璃珠無菌水的三角瓶中，放入30℃、120r/min的搖床，培養(yǎng)1d。

1.3.2纖維素降解菌的篩選（1）初篩：用稀釋涂布平板法，將10-7～10-4濃度的菌液涂于剛果紅纖維素鈉篩選培養(yǎng)基上，將平板分別放入30、50℃恒溫箱培養(yǎng)4d，挑取明顯的單菌落在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，將純化好的菌種接入PDA培養(yǎng)基斜面保存。（2）復(fù)篩：將純化好的菌株點(diǎn)接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，放入30、50℃培養(yǎng)4d，用剛果紅染液進(jìn)行染色，量取菌圈直徑（d）和透明圈直徑（D），并計算透明圈直徑與菌圈直徑比值D/d，選取D/d值與D值大的菌接入濾紙條液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行濾紙條崩潰試驗(yàn)，觀察濾紙條崩潰的快慢和程度。選取使濾紙條崩潰程度大的菌，分別接種于CMC-Na液體發(fā)酵培養(yǎng)基、豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，培養(yǎng)64h，測定纖維素酶活性。

1.3.3粗酶液的制備取發(fā)酵液倒入離心管中，3000r/min下離心10min，上清液即為粗酶液。

1.3.4纖維素酶活性測定[4-5]（1）羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測定：根據(jù)GB20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑》進(jìn)行羧甲基纖維素酶活測定；（2）濾紙酶（FPA）活性測定：根據(jù)NY/T1847—2010《微生物肥料生產(chǎn)菌株質(zhì)量評價通用技術(shù)要求》進(jìn)行濾紙酶活性測定。

1.3.5纖維素降解菌的初步鑒定[6-7]對篩選出的菌株菌落形態(tài)及顯微鏡下的形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。通過對照伯杰氏手冊完成對菌株的初步鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1菌種初篩

通過剛果紅纖維素鈉篩選培養(yǎng)基的篩選，共獲得21株菌，其中從土壤中分離出來的菌有9株，都為常溫菌；從牛糞中共分離出來12株菌，其中常溫菌6株，高溫菌6株。將分離出來的菌在PDA培養(yǎng)基劃線純化后接種到PDA斜面保存，待用。

2.2菌種復(fù)篩

用剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗(yàn)進(jìn)行菌種復(fù)篩，測試菌株的纖維素降解能力，詳見表1。王志超等認(rèn)為D/d值超過2.5的菌株纖維素酶活性高[8]。也有人認(rèn)為，D>2cm時，酶活較高。從表1可以看出，菌株P(guān)1、HN1的D/d值超過了2.5，且透明圈直徑D大于2cm；菌株P(guān)3、HP2、TG1、TG4的D/d值接近2.5，且透明圈直徑D大于或接近2cm，纖維素酶活性也相對比較高。

選用P1、HN1、TG1、HP2、P3做濾紙條崩潰試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可以看出，接種TG1濾紙條崩潰得最快最明顯，P1最不明顯。

綜合剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗(yàn)，篩選出HN1、TG1、HP2、P34株菌進(jìn)行后續(xù)纖維素酶活性的定量測定與菌株的初步鑒定。

2.3纖維素酶活性的測定結(jié)果

將篩選得到的4株菌分別接入CMC-Na液體發(fā)酵培養(yǎng)基、豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)64h，對其進(jìn)行CMCase酶活性和FPA酶活性的測定，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，TG1在CMC-Na液體發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的酶活性要高于其在豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的；HN1、HP2、P3這3株菌在豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性要高些，可以在后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)中作為參考菌株。

2.4纖維素降解菌的初步鑒定結(jié)果

2.4.1TG1鑒定結(jié)果（1）菌落特征：在高氏合成一號培養(yǎng)基上長的比較快，菌落為圓形，中間凸起，初期為白色，之后菌落出現(xiàn)灰色粉末物質(zhì)，易被挑取，有強(qiáng)烈的土腥味。（2）顯微觀察結(jié)果：革蘭氏染色為陽性，可看到孢子絲呈直形。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果初步鑒定TG1為放線菌。

2.4.2P3鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上干燥，呈半透明、邊緣不規(guī)則狀，培養(yǎng)基背面微發(fā)黃，有一定黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株P(guān)3呈短桿狀，有芽孢生成。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株P(guān)3為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為25～30℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)與甲基紅試驗(yàn)呈陽性，可降解淀粉，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，在初始pH值為9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果初步鑒定P3為枯草芽孢桿菌。endprint

2.4.3HN1鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)呈陽性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，可降解淀粉，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環(huán)境中生長，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴(kuò)張，不透明，背面呈現(xiàn)紅色，易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HP2可在有氧環(huán)境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環(huán)境中生長產(chǎn)生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)與甲基紅試驗(yàn)呈陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，篩選出4株對纖維素降解能力強(qiáng)的菌株。

用2種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對篩選出的4株菌進(jìn)行纖維素酶活性的定量測定，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)3、HN1、HP2在豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，在下一步進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復(fù)合酶。經(jīng)初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細(xì)菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]任平，趙文娟，張強(qiáng)，等.不同微生物酶對牛糞堆肥腐熟的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2525-2526，2592.

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[9]劉佳，李婉，許修宏，等.接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2011，32（10）：3073-3081.endprint

2.4.3HN1鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)呈陽性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，可降解淀粉，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環(huán)境中生長，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴(kuò)張，不透明，背面呈現(xiàn)紅色，易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HP2可在有氧環(huán)境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環(huán)境中生長產(chǎn)生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)與甲基紅試驗(yàn)呈陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，篩選出4株對纖維素降解能力強(qiáng)的菌株。

用2種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對篩選出的4株菌進(jìn)行纖維素酶活性的定量測定，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)3、HN1、HP2在豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，在下一步進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復(fù)合酶。經(jīng)初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細(xì)菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

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[9]劉佳，李婉，許修宏，等.接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2011，32（10）：3073-3081.endprint

2.4.3HN1鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)呈陽性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，可降解淀粉，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環(huán)境中生長，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結(jié)果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴(kuò)張，不透明，背面呈現(xiàn)紅色，易挑取。（2）顯微觀察結(jié)果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗(yàn)結(jié)果：菌株HP2可在有氧環(huán)境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環(huán)境中生長產(chǎn)生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應(yīng)與甲基紅試驗(yàn)呈陽性，產(chǎn)過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養(yǎng)基中生長良好。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，篩選出4株對纖維素降解能力強(qiáng)的菌株。

用2種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對篩選出的4株菌進(jìn)行纖維素酶活性的定量測定，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)3、HN1、HP2在豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶活性較高，在下一步進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復(fù)合酶。經(jīng)初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細(xì)菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

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