趙赟鑫+張歡+鄧百萬+謝海彬

摘要：以紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵的紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，利用HPLC法進(jìn)行檢測，篩選確定了發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是硝酸銨。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、硝酸銨6.0g/L、無水硫酸鎂0.3g/L，從而獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、KH2PO40.5g/L、無水MgSO40.3g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達(dá)到938.6μg/L。

關(guān)鍵詞：紅豆杉；紫杉醇；內(nèi)生真菌；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0389-04

紅豆杉通常為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（TaxusL.）植物的總稱，全世界有11種，分布于北半球的溫帶至熱帶地區(qū)[1]。中國有4種1變種，即紅豆杉（T.chinensisRehd.）、東北紅豆杉（T.cuspidataSieb.etZucc.）、西藏紅豆杉（T.wallichianaZucc.）、云南紅豆杉（T.yunnanensisChangetL.K.Fu）、南方紅豆杉（T.chinensisvar.maireiChangetL.K.Fu）[2]。

自從美國化學(xué)家Wani等首次從太平洋紫杉（短葉紅豆杉T.brevifoliaNutt.）中分離出紫杉醇（taxol）并于1971年將其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)表[3]，Schiff等證實(shí)紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制[4]，20世紀(jì)80年代美國和歐洲的科學(xué)家相繼揭示出紫杉醇的抗癌療效[5]。1993年，美國蒙大拿州大學(xué)植物病理系的Stierle博士等從短葉紅豆杉（T.brevifoliaNutt.）的韌皮部中分離得到1種能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌安德魯紫杉菌（Taxomycesandreanae）[6]。

近些年來，紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展很快，國內(nèi)外學(xué)者利用內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究報(bào)道逐漸增多，其關(guān)鍵問題在于紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)量的提高，要通過內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)至少是毫克級，但目前采用該方法的普遍產(chǎn)量只有幾百微克，主要是因?yàn)槿狈Ω弋a(chǎn)、穩(wěn)定的適于發(fā)酵的工業(yè)菌株，以及發(fā)酵條件的不合理而限制了單位發(fā)酵液中紫杉醇的含量。

培養(yǎng)基是人工配制的提供微生物生長、代謝、繁殖和合成人們所需目的產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)原料，同時(shí)，培養(yǎng)基也為微生物提供了營養(yǎng)物質(zhì)以外的其他生長所必需的環(huán)境條件。培養(yǎng)基的組成和配比是否恰當(dāng)對微生物的生長、產(chǎn)物的形成、產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量都有很大的影響。筆者采用課題組自行分離的紫杉醇高產(chǎn)菌株MetarhiziumanisopliaeLB-10[7]，對其培養(yǎng)基組成和配比進(jìn)行研究，優(yōu)化碳源、氮源、微量元素的組成、濃度及其配比，以為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10，為分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基，馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，水1.0L，pH值6.0～8.0；初始發(fā)酵液：葡萄糖80.0g/L，NH4NO38.0g/L，無水KH2PO40.5g/L，無水MgSO40.5g/L，維生素B10.05g/L；無碳配方發(fā)酵液：NH4NO38.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，ZnSO41.0mg/L，維生素B10.05g/L；無氮配方發(fā)酵液：葡萄糖80.0g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，ZnSO41.0mg/L，維生素B10.05g/L；優(yōu)化后發(fā)酵液：葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

1.1.3藥品與試劑

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%），乙酸乙酯，甲醇，葡萄糖，蔗糖，淀粉，麥芽糖，NH4NO3，（NH4）2SO4，蛋白胨，酒石酸銨，KH2PO4，MgSO4·7H2O。

1.1.4主要儀器

高效液相色譜儀（LC2000），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV-10，IKA），電子天平（TB-214），雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C），人工氣候箱（LRH-250-G-S），數(shù)控超聲波清洗儀（KQ-5200-DE）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)方法：在新鮮斜面上取5mm×5mm大小的已純化的菌塊，接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25℃、180r/min搖床上培養(yǎng)3d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液混勻，按3%接種量接種到裝有330mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，每次提取所用發(fā)酵液的量為1000mL，于28℃、180r/min搖床上培養(yǎng)10d。

1.2.2紫杉醇樣品的提取

通過對培養(yǎng)10d的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體兩部分，菌絲用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復(fù)3次，合并收集到的乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，樣品用甲醇溶解并定容至10.0mL，檢測。

1.2.3紫杉醇的HPLC檢測

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容至10.0mL，配置成0.01～0.16mg/mL的濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品4.0mg，甲醇定容至10.0mL，從而得到母液濃度為0.4mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16mg/mL，取20.0μL進(jìn)樣（n=5），得到回歸方程為y=6.0878+3589.3913x，r=0.9992。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，采用外標(biāo)法測定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯抽提物中紫杉醇含量。endprint

色譜條件：水-甲醇-乙腈（33∶35∶32）為流動(dòng)相，檢測波長為228nm，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20.0μL，柱溫為室溫，色譜柱為C18（4.6mm×150mm）。

紫杉醇含量計(jì)算公式：

發(fā)酵液中紫杉醇的含量（μg/L）=[甲醇中紫杉醇的含量（mg/mL）×溶解提取物所用甲醇的體積（mL）×106]/提取時(shí)所取發(fā)酵液的體積（mL）。

每次提取的紫杉醇均做3個(gè)平行樣，分別經(jīng)HPLC測定并通過公式計(jì)算發(fā)酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4生物量的測定

取一定體積的發(fā)酵液4800r/min離心20min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量，計(jì)算菌絲體生物量。

1.2.5培養(yǎng)基配方的優(yōu)化方法

1.2.5.1單因素試驗(yàn)

采取無碳配方發(fā)酵液培養(yǎng)，分別選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉為碳源，濃度均為80.0g/L，考察單因素碳源對LB-10紫杉醇積累和菌絲體生物量的影響，篩選出最適碳源進(jìn)行初糖濃度的單因素試驗(yàn)。

采取無氮配方發(fā)酵液培養(yǎng)，分別選?。∟H4）2SO4、NH4NO3、酒石酸銨和蛋白胨為氮源，濃度均為8.0g/L，考察單因素氮源對LB-10紫杉醇積累和菌絲體生物量的影響，篩選出最適氮源進(jìn)行初氮濃度的單因素試驗(yàn)。

采取初始發(fā)酵液培養(yǎng)，選取無水MgSO4的不同濃度4.0、6.0、8.0、10.0、12.0g/L，研究無水MgSO4的不同濃度對LB-10菌體紫杉醇生物合成產(chǎn)量和菌絲體生物量的單因素影響。

1.2.5.2正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn)

選取對菌體生長和紫杉醇積累有較大影響的最適碳源、最適氮源和硫酸鎂濃度，分別取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)以及驗(yàn)證性試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1不同碳源的影響

生成次級代謝產(chǎn)物是由許多因素來調(diào)控的，比如碳源、氮源及微量元素[8]。碳源的主要作用是構(gòu)成各種代謝產(chǎn)物的碳架和細(xì)胞物質(zhì)，以及提供細(xì)胞活動(dòng)所需的能量。

由圖2可知，生物量以蔗糖最高，葡萄糖次之，麥芽糖最低；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，以淀粉為碳源時(shí)，菌絲生長相對緩慢，老化快。紫杉醇產(chǎn)量以葡萄糖為碳源的最高，蔗糖次之，麥芽糖產(chǎn)紫杉醇量最低。

試驗(yàn)結(jié)果表明，以蔗糖為碳源時(shí)對菌體生長比對紫杉醇積累更有利，以麥芽糖為碳源時(shí)對紫杉醇積累和菌體生長均不利，以葡糖糖為碳源時(shí)對紫杉醇積累比對菌體生長更有利，因此選擇葡萄糖為最適碳源。

2.2不同氮源的影響

氮源是生命有機(jī)體生長發(fā)育所必需的主要營養(yǎng)，主要是合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和提供原生質(zhì)的原料，一般所用的氮源可分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源2類。NH4NO3、（NH4）2SO4、酒石酸銨和蛋白胨等被國內(nèi)學(xué)者研究時(shí)作為氮源使用[9]。

如圖3所示，以NH4NO3為氮源時(shí)菌體生物量和紫杉醇產(chǎn)量最高，蛋白胨次之，（NH4）2SO4為氮源時(shí)紫杉醇產(chǎn)量和菌體生物量均最低。

試驗(yàn)結(jié)果表明，以蛋白胨、NH4NO3為氮源時(shí)對紫杉醇積累和菌體生長有促進(jìn)作用，而采用（NH4）2SO4為氮源時(shí)對菌體的代謝有抑制作用，從而降低了紫杉醇的產(chǎn)量，因此選擇NH4NO3為最適氮源。

2.3不同初糖濃度的影響

糖類的濃度對紫杉醇的生物合成和內(nèi)生真菌的生長具有很大影響。本試驗(yàn)采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，以葡萄糖為碳源，分別按照濃度50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0g/L的添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察不同的碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)對LB-10產(chǎn)量的影響。

由圖4可知，LB-10產(chǎn)紫杉醇的含量首先隨著葡萄糖濃度升高而增加，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到60.0g/L時(shí)，紫杉醇產(chǎn)量以及菌體生物量達(dá)到最大。當(dāng)碳源濃度為70.0g/L及以上時(shí)，

菌體生長受到了抑制，紫杉醇產(chǎn)量及菌體生物量都有所下降。結(jié)果表明，初糖濃度直接影響產(chǎn)物的積累和菌體的生長。當(dāng)初糖濃度較高時(shí)，碳源更多地流向代謝產(chǎn)物的合成，隨著發(fā)酵時(shí)間持續(xù)，形成了大量非目的產(chǎn)物，抑制目的代謝產(chǎn)物的積累和菌絲體的生長，導(dǎo)致在初糖濃度較高的條件下，發(fā)酵液變得稠厚，使能量傳遞以及物質(zhì)轉(zhuǎn)化變得困難，最終導(dǎo)致紫杉醇的產(chǎn)生受到抑制。因此最佳碳源濃度用量的選擇為60.0g/L。

2.4不同NH4NO3濃度的影響

提高培養(yǎng)基中氮源濃度對紅豆杉內(nèi)生真菌的生長以及紫杉醇的生物合成也具有很大的影響。本試驗(yàn)同樣采用了初始發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，以NH4NO3為氮源，選取不同的氮源濃度4.0、6.0、8.0、10.0、12.0g/L進(jìn)行試驗(yàn)，不同氮源濃度對LB-10發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的影響結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)?shù)礉舛葹?.0g/L時(shí)，紫杉醇的生物合成量達(dá)到最大；當(dāng)?shù)礉舛葹?2.0g/L時(shí)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)菌絲體生物量達(dá)到了最大，而紫杉醇含量最低。結(jié)果表明，初始氮源濃度對紫杉醇積累和菌體生長有顯著影響。高濃度氮源對紅豆杉內(nèi)生真菌的生長起到促進(jìn)作用，但是抑制次級代謝產(chǎn)物的形成；隨著NH4NO3濃度升高，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被用來合成大量的菌絲體，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，從而菌絲體過早地衰老，對后續(xù)合成及積累紫杉醇不利。因此為了兼顧紫杉醇含量和菌絲體生長，選擇6.0g/LNH4NO3為最佳氮源用量。

2.5不同MgSO4濃度的影響

由于在紫杉醇生物合成過程中，第一步限速反應(yīng)是GGPP在紫杉二烯合成酶（taxadienesynthase）的催化下環(huán)化為紫杉烷三環(huán)二萜骨架，反應(yīng)產(chǎn)物是taxa-4（5）、11（12）-diene，該酶是以Mg2+為唯一金屬催化劑的蛋白單體[10]，Mg2+的濃度對該酶的活性影響很大，進(jìn)而影響紫杉醇的生物合成。endprint

由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時(shí)菌絲體生物量達(dá)到最高，紫杉醇的生物合成量也達(dá)到最大值；繼續(xù)提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產(chǎn)量都開始下降。結(jié)果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環(huán)二萜骨架的合成，進(jìn)而會(huì)降低紫杉醇產(chǎn)量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

以上分析了培養(yǎng)基各組分及其濃度對發(fā)酵試驗(yàn)的單因素影響，因?yàn)楦鱾€(gè)試驗(yàn)批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進(jìn)行綜合考察，才能篩選出較優(yōu)的工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過多個(gè)因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時(shí)能夠獲得各因素對試驗(yàn)的影響規(guī)律，從而確定較優(yōu)的工藝條件配比。

本試驗(yàn)選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，結(jié)果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小，得到3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)锽>C>A，即NH4NO3濃度對產(chǎn)量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結(jié)果可知，NH4NO3對紫杉醇產(chǎn)量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個(gè)因素對紫杉醇產(chǎn)量影響均顯著。

以3個(gè)因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現(xiàn)下降趨勢，因素B是先上升后下降，結(jié)果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，對LB-10菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證性試驗(yàn)，分別提取5次紫杉醇樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，LB-10產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現(xiàn)性較好，紫杉醇含量的平均值達(dá)到938.6μg/L，產(chǎn)量比常規(guī)方法提高了92.5μg/L。

3討論與結(jié)論

在筆者課題組自行篩選的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎(chǔ)上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗(yàn)分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進(jìn)一步采取L9（34）正交試驗(yàn)分析，獲得了三者在培養(yǎng)基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達(dá)到了938.6μg/L。

研究發(fā)現(xiàn)，濃度適量的碳源和氮源都促進(jìn)紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當(dāng)兩者濃度過高時(shí)，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被用來合成大量菌絲體，導(dǎo)致營養(yǎng)消耗過快，大量非目的產(chǎn)物的形成會(huì)抑制目的代謝產(chǎn)物的積累和菌體生長，發(fā)酵液會(huì)變得稠厚，進(jìn)而菌絲體過早衰老，對后續(xù)合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

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由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時(shí)菌絲體生物量達(dá)到最高，紫杉醇的生物合成量也達(dá)到最大值；繼續(xù)提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產(chǎn)量都開始下降。結(jié)果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環(huán)二萜骨架的合成，進(jìn)而會(huì)降低紫杉醇產(chǎn)量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

以上分析了培養(yǎng)基各組分及其濃度對發(fā)酵試驗(yàn)的單因素影響，因?yàn)楦鱾€(gè)試驗(yàn)批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進(jìn)行綜合考察，才能篩選出較優(yōu)的工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過多個(gè)因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時(shí)能夠獲得各因素對試驗(yàn)的影響規(guī)律，從而確定較優(yōu)的工藝條件配比。

本試驗(yàn)選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，結(jié)果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小，得到3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)锽>C>A，即NH4NO3濃度對產(chǎn)量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結(jié)果可知，NH4NO3對紫杉醇產(chǎn)量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個(gè)因素對紫杉醇產(chǎn)量影響均顯著。

以3個(gè)因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現(xiàn)下降趨勢，因素B是先上升后下降，結(jié)果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，對LB-10菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證性試驗(yàn)，分別提取5次紫杉醇樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，LB-10產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現(xiàn)性較好，紫杉醇含量的平均值達(dá)到938.6μg/L，產(chǎn)量比常規(guī)方法提高了92.5μg/L。

3討論與結(jié)論

在筆者課題組自行篩選的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎(chǔ)上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗(yàn)分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進(jìn)一步采取L9（34）正交試驗(yàn)分析，獲得了三者在培養(yǎng)基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達(dá)到了938.6μg/L。

研究發(fā)現(xiàn)，濃度適量的碳源和氮源都促進(jìn)紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當(dāng)兩者濃度過高時(shí)，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被用來合成大量菌絲體，導(dǎo)致營養(yǎng)消耗過快，大量非目的產(chǎn)物的形成會(huì)抑制目的代謝產(chǎn)物的積累和菌體生長，發(fā)酵液會(huì)變得稠厚，進(jìn)而菌絲體過早衰老，對后續(xù)合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

參考文獻(xiàn)：

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典（修訂版）[M].北京：科學(xué)出版社，1982：481.

[2]中國科學(xué)院植物研究所編輯委員會(huì).中國植物志：第七卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：438-443.

[3]WaniMC，TaylorHL，WallME，etal.Plantantitumoragents.Ⅵ.Theisolationandstructureoftaxol，anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1971，93（9）：2325-2327.

[4]SchiffPB，F(xiàn)antJ，HorwitzSB.Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5]梅興國，魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其他疾病的潛力[J].國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊，1996，23（3）：136-1367，138-140.

[6]StrobelGA，StierleA，StierleD，etal.Taxomycesandreanae，aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassotiatedwithPacificyew[J].Mycotaxon，1993，47：71-78.

[7]耿直，劉開輝，趙赟鑫，等.一株產(chǎn)紫杉醇中國紅豆杉內(nèi)生真菌的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（2）：199-203.

[8]ParraR，AldredD，MaganN.MediumoptimizationfortheproductionofthesecondarymetabolitesqualestatinS1byaPhomasp.combiningorthogonaldesignandresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2005，37（7）：704-711.

[9]代文亮.產(chǎn)紫杉醇菌種的改良及若干種前體物質(zhì)作用的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[10]宣紅玉，劉家新，王健剛，等.紫杉醇生物合成途徑及調(diào)控研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10（3）：96-102.endprint

由圖6可以看出，隨著無水MgSO4濃度升高，紫杉醇的生物合成量呈上升趨勢，在MgSO4濃度為0.5g/L時(shí)菌絲體生物量達(dá)到最高，紫杉醇的生物合成量也達(dá)到最大值；繼續(xù)提高濃度，菌絲體生物量和紫杉醇產(chǎn)量都開始下降。結(jié)果表明，Mg2+濃度對菌絲體生長和紫杉醇積累有一定的影響。Mg2+濃度過高，使紫杉二烯合成酶活性受到抑制，影響紫杉烷三環(huán)二萜骨架的合成，進(jìn)而會(huì)降低紫杉醇產(chǎn)量。因此最佳MgSO4用量為濃度0.5g/L。

2.6培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

以上分析了培養(yǎng)基各組分及其濃度對發(fā)酵試驗(yàn)的單因素影響，因?yàn)楦鱾€(gè)試驗(yàn)批次之間往往差別較大，所以需要對各因素進(jìn)行綜合考察，才能篩選出較優(yōu)的工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可通過多個(gè)因素的分析得到各因素在整體影響中的主次，同時(shí)能夠獲得各因素對試驗(yàn)的影響規(guī)律，從而確定較優(yōu)的工藝條件配比。

本試驗(yàn)選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有較大影響的葡萄糖、NH4NO3和MgSO4，分別取3個(gè)水平，以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，結(jié)果如表2和表3所示。

由表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小，得到3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)锽>C>A，即NH4NO3濃度對產(chǎn)量影響最大，其次是MgSO4濃度，最后是葡萄糖濃度。

由表3方差分析結(jié)果可知，NH4NO3對紫杉醇產(chǎn)量的影響極顯著[F>F0.01（2，2）]，葡萄糖對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，MgSO4對紫杉醇產(chǎn)量的影響顯著[F0.01（2，2）>F>F0.05（2，2）]，因此選取的3個(gè)因素對紫杉醇產(chǎn)量影響均顯著。

以3個(gè)因素在不同水平下的均值對各水平作圖，如圖7所示，對于因素A和因素C，其均值水平變化呈現(xiàn)下降趨勢，因素B是先上升后下降，結(jié)果表明，最佳組合為A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、MgSO40.3g/L。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。

2.7驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用優(yōu)化后發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)，即葡萄糖50.0g/L，NH4NO36.0g/L，無水MgSO40.3g/L，KH2PO40.5g/L，維生素B10.05g/L。以紫杉醇產(chǎn)量為指標(biāo)，對LB-10菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證性試驗(yàn)，分別提取5次紫杉醇樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，LB-10產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量的RSD為0.33%，說明測定方法的重現(xiàn)性較好，紫杉醇含量的平均值達(dá)到938.6μg/L，產(chǎn)量比常規(guī)方法提高了92.5μg/L。

3討論與結(jié)論

在筆者課題組自行篩選的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌MetarhiziumanisopliaeLB-10的基礎(chǔ)上，篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為NH4NO3。通過單因素試驗(yàn)分析，確定了葡萄糖、NH4NO3、無水MgSO4的最適濃度分別為60.0、6.0、0.5g/L。

進(jìn)一步采取L9（34）正交試驗(yàn)分析，獲得了三者在培養(yǎng)基中的最佳組合A1B2C1，即葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L，從而獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：葡萄糖50.0g/L、NH4NO36.0g/L、無水MgSO40.3g/L、KH2PO40.5g/L、維生素B10.05g/L，其紫杉醇平均含量達(dá)到了938.6μg/L。

研究發(fā)現(xiàn)，濃度適量的碳源和氮源都促進(jìn)紫杉醇生物合成和菌體生長，但是當(dāng)兩者濃度過高時(shí)，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被用來合成大量菌絲體，導(dǎo)致營養(yǎng)消耗過快，大量非目的產(chǎn)物的形成會(huì)抑制目的代謝產(chǎn)物的積累和菌體生長，發(fā)酵液會(huì)變得稠厚，進(jìn)而菌絲體過早衰老，對后續(xù)合成和積累紫杉醇均不利。因此，為了兼顧紫杉醇含量和菌體生長，需要選擇適宜的碳氮比。

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[4]SchiffPB，F(xiàn)antJ，HorwitzSB.Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature，1979，277（5698）：665-667.

[5]梅興國，魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其他疾病的潛力[J].國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊，1996，23（3）：136-1367，138-140.

[6]StrobelGA，StierleA，StierleD，etal.Taxomycesandreanae，aproposednewtaxonforabulbilliferoushyphomyceteassotiatedwithPacificyew[J].Mycotaxon，1993，47：71-78.

[7]耿直，劉開輝，趙赟鑫，等.一株產(chǎn)紫杉醇中國紅豆杉內(nèi)生真菌的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（2）：199-203.

[8]ParraR，AldredD，MaganN.MediumoptimizationfortheproductionofthesecondarymetabolitesqualestatinS1byaPhomasp.combiningorthogonaldesignandresponsesurfacemethodology[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2005，37（7）：704-711.

[9]代文亮.產(chǎn)紫杉醇菌種的改良及若干種前體物質(zhì)作用的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[10]宣紅玉，劉家新，王健剛，等.紫杉醇生物合成途徑及調(diào)控研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10（3）：96-102.endprint