翁梁+溫魯

摘要：以蠶蛹、黃豆、玉米糝、蛋白胨為原料固體栽培蛹蟲草，研究不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量的影響。結(jié)果表明，配方5下蛹蟲草蟲草素含量最高，配方1下腺苷含量最高，配方4下多糖、蟲草酸含量最高，在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝、蛋白胨有利于蛹蟲草活性物質(zhì)的提高。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；配方培養(yǎng)基；蟲草素；腺苷；多糖；蟲草酸

中圖分類號：S567.3+50.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0351-02

蛹蟲草別稱北冬蟲夏草、北蟲草等，是冬蟲夏草的近緣種，也是蟲草屬真菌的模式種[1]，其活性成分和醫(yī)療保健功效與冬蟲夏草相近。冬蟲夏草由于生境特殊、寄主單一、產(chǎn)量較低，加之人工培育技術(shù)難以突破，市場價格高昂。蛹蟲草可以進(jìn)行人工培育，其主要活性成分有蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸，特別是蟲草素含量遠(yuǎn)高于冬蟲夏草[2]，在藥理或臨床試驗(yàn)中可作為冬蟲夏草的替代品。蛹蟲草人工培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、液體發(fā)酵、有蠶培養(yǎng)、蛹培養(yǎng)，還有用大米、小麥代料栽培或添加微量元素等，并在一些地區(qū)形成規(guī)模，但培育的蛹蟲草活性成分含量不高。目前，以提高蛹蟲草活性物質(zhì)含量為指標(biāo)，對蛹蟲草發(fā)酵條件的優(yōu)化研究從未間斷，也取得了很大進(jìn)展[3-5]。本研究采用固體培養(yǎng)，以蠶蛹作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適量添加黃豆、玉米糝、蛋白胨，比較不同配方對蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量的影響，以期為蛹蟲草活性物質(zhì)含量研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：蛹蟲草H-3麥粒菌種，江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營養(yǎng)工程學(xué)院食用菌課題組自行培育。

材料：蠶蛹（江蘇省淮安市絲織廠），蛋白胨（生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），黃豆、玉米糝購自江蘇省淮安市農(nóng)貿(mào)市場。

藥品與試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、葡萄糖、D-甘露醇、高碘酸鈉、乙酸銨、冰醋酸、無水乙醇、苯酚、98%濃硫酸、磷酸氫二鉀、四氫呋喃等均為分析純，培養(yǎng)用水為自來水，分析用水為雙蒸水。蟲草素對照品、腺苷對照品由上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝。

1.2儀器設(shè)備

培養(yǎng)設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱；樣品處理設(shè)備：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，粉碎機(jī)，臺式離心機(jī)，電子天平，微波爐等；檢測設(shè)備：美國Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)（600Epump，600controller，2487紫外檢測器，In-lineDegasserAF在線脫氣機(jī)，Empower色譜數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)）。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基配制配方1：蠶蛹200g（蠶蛹干質(zhì)量100g，按50%折算，下同），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，5mL水。配方2：蠶蛹140g，黃豆30g（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為7∶3），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，45mL水。配方3：蠶蛹120g、黃豆40g（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為6∶4），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，60mL水。配方4：蠶蛹100g、黃豆50g（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為5∶5），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，75mL水。配方5：蠶蛹140g、玉米糝30g（蠶蛹與玉米糝質(zhì)量比為7∶3），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，30mL水。配方6：蠶蛹120g、玉米糝40g（蠶蛹與玉米糝質(zhì)量比為6∶4），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，40mL水。配方7：蠶蛹190g、蛋白胨5g（蠶蛹與蛋白胨質(zhì)量比為95∶5），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，10mL水。配方8：蠶蛹180g、蛋白胨10g（蠶蛹與蛋白胨質(zhì)量比為9∶1），加1.5%硫酸鈣，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，2%紅糖，20mL水。

1.3.2接種培養(yǎng)將配制好的培養(yǎng)基于115℃滅菌90min，冷卻。在超凈工作臺上按無菌操作要求接入蛹蟲草H-3菌種，每瓶接6粒麥粒菌種，置培養(yǎng)箱中于25℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)物于60℃烘干，粉碎待測。

1.3.3樣品處理采用微波法提取樣品[6]。稱取一定量樣品粉末，用水作提取介質(zhì)，料液比1∶100，經(jīng)微波法輔助提取，并將提取液離心得上清液，備用。

1.3.4蟲草素與腺苷測定采用HPLC法測定蛹蟲草蟲草素與腺苷[6]，上清液經(jīng)0.2μm微孔濾膜壓濾，色譜條件為：WatersNova-pakC18（3.9mm×300.0mm，4μm）；流動相為KH2PO4-K2HPO4+1%（體積分?jǐn)?shù)）四氫呋喃緩沖液，pH值為6.86，流速為1.0mL/min，檢測波長260nm。蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.10×106x-1.34×104，r=0.9999；腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.55×106x-5.72×103，r=0.9999；式中y為色譜峰面積，x為蟲草素或腺苷的進(jìn)樣量。

1.3.5蛹蟲草多糖測定蛹蟲草多糖測定采用苯酚-硫酸法[7-8]。多糖在酸性條件下水解成葡萄糖等單糖，用葡萄糖配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于490nm處測定吸光度，得到葡萄糖含量（C葡萄糖）與吸光度（D）的回歸方程：D=7.3542C葡萄糖+0.0532，r=0.9996。

1.3.6蟲草酸測定采用高碘酸鈉比色法測定蟲草酸[9]。蟲草酸的化學(xué)成分為D-甘露醇，用甘露醇配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于420nm處測定吸光度，得到甘露糖含量（C甘露糖）與吸光度（D）的回歸方程：C甘露糖=104.5500D+0.3012，r=0.9999。

2結(jié)果與分析

2.1不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草蟲草素含量的影響endprint

蠶蛹營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，而且蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，可直接作為蛹蟲草生長的培養(yǎng)基。由表1可知，試驗(yàn)所用8種培養(yǎng)基均適合蛹蟲草生長，蟲草素含量也較高，其中配方5下蛹蟲草蟲草素含量最高，達(dá)4.75mg/g。配方5和配方6蟲草素含量差異顯著，配方5、6與配方1、2、3、4、7、8蟲草素含量差異極顯著。從表1還可見，配方5、6、7、8蟲草素含量大于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝、蛋白胨有利于蟲草素積累；配方2、3、4蟲草素含量小于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆未能提高蛹蟲草蟲草素含量。

2.2不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草腺苷含量的影響

由表2可知，配方1下蛹蟲草腺苷含量最高，達(dá)0.55mg/g，其次為配方5，配方8下蛹蟲草腺苷含量最低。配方1、5與配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差異極顯著。試驗(yàn)表明，在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆、玉米糝、蛋白胨均未能顯著提高蛹蟲草腺苷含量。

2.3不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草多糖含量的影響

表3顯示，配方4下蛹蟲草多糖含量最高，達(dá)75.67mg/g，配方8下蛹蟲草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差異極顯著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差異極顯著，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累。

2.4不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草蟲草酸含量的影響

由表4可知，配方4下蛹蟲草蟲草酸含量最高，達(dá)76.73mg/g，配方3下蛹蟲草蟲草酸含量最低。配方4和其他配方下的蟲草酸含量差異極顯著。

3結(jié)論與討論

本研究對不同配方培養(yǎng)基處理下的蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，配方5（蠶蛹與玉米糝質(zhì)量比為7∶3）下蛹蟲草蟲草素含量最高，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝可顯著提高蟲草素含量；在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累；配方4（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為5∶5）下蛹蟲草蟲草酸含量最高。綜上，以純蛹為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝、蛋白胨有利于蛹蟲草蟲草素、多糖、蟲草酸含量的提高。但在該試驗(yàn)條件下，腺苷含量沒有顯著提高。如要提高腺苷含量，還須進(jìn)一步研究。

蠶蛹營養(yǎng)價值高，可直接作為蛹蟲草的培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝后培養(yǎng)基碳氮比更加合理，有利于蛹蟲草活性物質(zhì)產(chǎn)生和積累。如果再配合其他育種技術(shù)，會使活性成分總量得到進(jìn)一步提高。在純蛹培養(yǎng)基中添加其他成分能否進(jìn)一步提高蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量，還須深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]敬一兵，陸魯生.蟲草[M].昆明：云南科技出版社，1986：24.

[2]韋會平，肖波，胡開治.蛹蟲草藥用價值考[J].中藥材，2004，27（3）：215-217.

[3]林群英，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（4）：154-157.

[4]翁梁，溫魯.硒和鈣對蛹蟲草活性物質(zhì)含量的影響[J].北方園藝，2012（22）：159-161.

[5]王志高，溫魯，袁小轉(zhuǎn)，等.加硒對蛹蟲草主要活性成分含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（29）：9293-9294.[HJ1.9mm]

[6]翁梁，溫魯.TLCS與HPLC對比測定蟲草中蟲草素和腺苷含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（4）：539-540.

[7]翁梁，溫魯，楊芳，等.不同提取方法對蛹蟲草多糖抗氧化性的影響[J].食品科技，2008，33（11）：180-182.

[8]汪瓊，徐增萊，呂曄.微波消解ICP-MS法測定冬蟲夏草中30種無機(jī)元素含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：269-270.

[9]溫魯，翁梁，朱明偉，等.不同林區(qū)蛹蟲草活性成分含量的比較[J].林業(yè)科學(xué)，2008，44（8）：149-151.endprint

蠶蛹營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，而且蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，可直接作為蛹蟲草生長的培養(yǎng)基。由表1可知，試驗(yàn)所用8種培養(yǎng)基均適合蛹蟲草生長，蟲草素含量也較高，其中配方5下蛹蟲草蟲草素含量最高，達(dá)4.75mg/g。配方5和配方6蟲草素含量差異顯著，配方5、6與配方1、2、3、4、7、8蟲草素含量差異極顯著。從表1還可見，配方5、6、7、8蟲草素含量大于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝、蛋白胨有利于蟲草素積累；配方2、3、4蟲草素含量小于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆未能提高蛹蟲草蟲草素含量。

2.2不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草腺苷含量的影響

由表2可知，配方1下蛹蟲草腺苷含量最高，達(dá)0.55mg/g，其次為配方5，配方8下蛹蟲草腺苷含量最低。配方1、5與配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差異極顯著。試驗(yàn)表明，在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆、玉米糝、蛋白胨均未能顯著提高蛹蟲草腺苷含量。

2.3不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草多糖含量的影響

表3顯示，配方4下蛹蟲草多糖含量最高，達(dá)75.67mg/g，配方8下蛹蟲草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差異極顯著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差異極顯著，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累。

2.4不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草蟲草酸含量的影響

由表4可知，配方4下蛹蟲草蟲草酸含量最高，達(dá)76.73mg/g，配方3下蛹蟲草蟲草酸含量最低。配方4和其他配方下的蟲草酸含量差異極顯著。

3結(jié)論與討論

本研究對不同配方培養(yǎng)基處理下的蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，配方5（蠶蛹與玉米糝質(zhì)量比為7∶3）下蛹蟲草蟲草素含量最高，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝可顯著提高蟲草素含量；在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累；配方4（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為5∶5）下蛹蟲草蟲草酸含量最高。綜上，以純蛹為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝、蛋白胨有利于蛹蟲草蟲草素、多糖、蟲草酸含量的提高。但在該試驗(yàn)條件下，腺苷含量沒有顯著提高。如要提高腺苷含量，還須進(jìn)一步研究。

蠶蛹營養(yǎng)價值高，可直接作為蛹蟲草的培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝后培養(yǎng)基碳氮比更加合理，有利于蛹蟲草活性物質(zhì)產(chǎn)生和積累。如果再配合其他育種技術(shù)，會使活性成分總量得到進(jìn)一步提高。在純蛹培養(yǎng)基中添加其他成分能否進(jìn)一步提高蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量，還須深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]敬一兵，陸魯生.蟲草[M].昆明：云南科技出版社，1986：24.

[2]韋會平，肖波，胡開治.蛹蟲草藥用價值考[J].中藥材，2004，27（3）：215-217.

[3]林群英，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（4）：154-157.

[4]翁梁，溫魯.硒和鈣對蛹蟲草活性物質(zhì)含量的影響[J].北方園藝，2012（22）：159-161.

[5]王志高，溫魯，袁小轉(zhuǎn)，等.加硒對蛹蟲草主要活性成分含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（29）：9293-9294.[HJ1.9mm]

[6]翁梁，溫魯.TLCS與HPLC對比測定蟲草中蟲草素和腺苷含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（4）：539-540.

[7]翁梁，溫魯，楊芳，等.不同提取方法對蛹蟲草多糖抗氧化性的影響[J].食品科技，2008，33（11）：180-182.

[8]汪瓊，徐增萊，呂曄.微波消解ICP-MS法測定冬蟲夏草中30種無機(jī)元素含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：269-270.

[9]溫魯，翁梁，朱明偉，等.不同林區(qū)蛹蟲草活性成分含量的比較[J].林業(yè)科學(xué)，2008，44（8）：149-151.endprint

蠶蛹營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，而且蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，可直接作為蛹蟲草生長的培養(yǎng)基。由表1可知，試驗(yàn)所用8種培養(yǎng)基均適合蛹蟲草生長，蟲草素含量也較高，其中配方5下蛹蟲草蟲草素含量最高，達(dá)4.75mg/g。配方5和配方6蟲草素含量差異顯著，配方5、6與配方1、2、3、4、7、8蟲草素含量差異極顯著。從表1還可見，配方5、6、7、8蟲草素含量大于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝、蛋白胨有利于蟲草素積累；配方2、3、4蟲草素含量小于配方1，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆未能提高蛹蟲草蟲草素含量。

2.2不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草腺苷含量的影響

由表2可知，配方1下蛹蟲草腺苷含量最高，達(dá)0.55mg/g，其次為配方5，配方8下蛹蟲草腺苷含量最低。配方1、5與配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差異極顯著。試驗(yàn)表明，在純蛹培養(yǎng)基中添加黃豆、玉米糝、蛋白胨均未能顯著提高蛹蟲草腺苷含量。

2.3不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草多糖含量的影響

表3顯示，配方4下蛹蟲草多糖含量最高，達(dá)75.67mg/g，配方8下蛹蟲草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差異極顯著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差異極顯著，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累。

2.4不同配方培養(yǎng)基對蛹蟲草蟲草酸含量的影響

由表4可知，配方4下蛹蟲草蟲草酸含量最高，達(dá)76.73mg/g，配方3下蛹蟲草蟲草酸含量最低。配方4和其他配方下的蟲草酸含量差異極顯著。

3結(jié)論與討論

本研究對不同配方培養(yǎng)基處理下的蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，配方5（蠶蛹與玉米糝質(zhì)量比為7∶3）下蛹蟲草蟲草素含量最高，說明在純蛹培養(yǎng)基中添加適量玉米糝可顯著提高蟲草素含量；在純蛹培養(yǎng)基中添加適量黃豆、玉米糝有利于蛹蟲草多糖的產(chǎn)生和積累；配方4（蠶蛹與黃豆質(zhì)量比為5∶5）下蛹蟲草蟲草酸含量最高。綜上，以純蛹為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝、蛋白胨有利于蛹蟲草蟲草素、多糖、蟲草酸含量的提高。但在該試驗(yàn)條件下，腺苷含量沒有顯著提高。如要提高腺苷含量，還須進(jìn)一步研究。

蠶蛹營養(yǎng)價值高，可直接作為蛹蟲草的培養(yǎng)基，添加適量黃豆、玉米糝后培養(yǎng)基碳氮比更加合理，有利于蛹蟲草活性物質(zhì)產(chǎn)生和積累。如果再配合其他育種技術(shù)，會使活性成分總量得到進(jìn)一步提高。在純蛹培養(yǎng)基中添加其他成分能否進(jìn)一步提高蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖、蟲草酸含量，還須深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]敬一兵，陸魯生.蟲草[M].昆明：云南科技出版社，1986：24.

[2]韋會平，肖波，胡開治.蛹蟲草藥用價值考[J].中藥材，2004，27（3）：215-217.

[3]林群英，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（4）：154-157.

[4]翁梁，溫魯.硒和鈣對蛹蟲草活性物質(zhì)含量的影響[J].北方園藝，2012（22）：159-161.

[5]王志高，溫魯，袁小轉(zhuǎn)，等.加硒對蛹蟲草主要活性成分含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（29）：9293-9294.[HJ1.9mm]

[6]翁梁，溫魯.TLCS與HPLC對比測定蟲草中蟲草素和腺苷含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（4）：539-540.

[7]翁梁，溫魯，楊芳，等.不同提取方法對蛹蟲草多糖抗氧化性的影響[J].食品科技，2008，33（11）：180-182.

[8]汪瓊，徐增萊，呂曄.微波消解ICP-MS法測定冬蟲夏草中30種無機(jī)元素含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：269-270.

[9]溫魯，翁梁，朱明偉，等.不同林區(qū)蛹蟲草活性成分含量的比較[J].林業(yè)科學(xué)，2008，44（8）：149-151.endprint