董曉婭+邱白晶+管賢平

摘要：基于氨基甲酸酯類農藥抑制乙酰膽堿酯酶活性的原理，以硫化鎘-石墨烯納米復合物為酶固定化材料，以西維因作為模型化合物構建了基于乙酰膽堿酯酶的氨基甲酸酯類農藥的生物傳感平臺。結果表明，固定在硫化鎘-石墨烯納米復合材料上的乙酰膽堿酯酶與氯化硫代乙酰膽堿的親和能力強，并且硫化鎘-石墨烯納米復合材料上的乙酰膽堿酯酶對氯化硫代乙酰膽堿的催化活性高，其米氏常數Km為0.24mmol；由于硫化鎘-石墨烯納米復合材料的引入，增加了氯化硫代乙酰膽堿在電極表面的電子轉移速度，提高了檢測的靈敏度；該傳感器對西維因的檢測范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測限為0.72ng/mL，研究結果為氨基甲酸酯類農藥的快速檢測提供了一種有效的途徑。

關鍵詞：黃瓜；西維因；農藥殘留；電化學方法；生物傳感平臺

中圖分類號：TQ450.2+63文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0337-02

農藥在保護農作物、防治病蟲草害、改善人類生存環(huán)境、控制疾病等方面發(fā)揮了巨大作用，因而農藥的使用給人們帶來了巨大的經濟效益和社會效益，對人類生存起到了重要作用。但是隨著農藥使用范圍的逐漸擴大和使用量的不斷增加，逐漸暴露了其作為污染物的不足以及由此造成的眾多環(huán)境及食物安全問題[1]。近年來，氨基甲酸酯類農藥的廣泛使用已經嚴重威脅到人類的健康以及環(huán)境和食品安全，并引起了社會的普遍關注，因此實現氨基甲酸酯類農藥的快速和靈敏檢測具有十分重要的意義[2]。

目前對農藥中氨基甲酸酯類農藥的檢測方法主要包括氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、毛細管電泳、色譜-質譜聯(lián)用技術、流動注射分析法等。這些方法均存在樣品前處理復雜、儀器設備昂貴、分析費時長、要求熟練的技術人員才能完成等問題。因此，開發(fā)靈敏度高、方便快捷、準確安全、特異性強的檢測新技術，實現對農藥進行痕量檢測已成為迫在眉睫的重要研究課題之一。電化學檢測方法以其靈敏度高、速度快、花費低、危害低等優(yōu)越性，已經在諸多的測定技術中脫穎而出[3]，并廣泛應用于環(huán)境、醫(yī)藥、食品發(fā)酵等領域。電化學分析的另一特點是儀器簡單，不受體系濁度和顏色影響，其安培檢測信號與待測物質的濃度呈線性關系，因而可將檢測信號轉換為直觀易讀的濃度值，便于非專業(yè)人士使用[4]。本試驗采用電化學方法對黃瓜中西維因的殘留量進行分析，該方法簡單、準確、重現性好，可以適用于農藥的快速檢測。

1材料與方法

1.1試驗時間與地點

試驗于2014年春季在江蘇大學玻璃溫室內進行。

1.2試驗材料

以新津春四F1為試驗對象，在黃瓜開花當天，用西維因噴灑花朵，進行正常田間管理。隨機摘取花后6、8、10d的黃瓜，分別將其粉碎，各個樣品隨機稱取20g并分別放入取樣瓶中，加入30mL丙酮劇烈震動混勻，離心5min后取上清液，經過旋轉蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加入100mL磷酸鹽緩沖液（PBS）。

西維因標準品、乙酰膽堿酯酶、氯化硫代乙酰膽堿，購于Sigma-Aldrich試劑公司；西維因水劑，購自當地市場；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司。

KQ-100型超聲波清洗器，購于昆山市超聲儀器有限公司；JB-1型攪拌器，購于上海雷磁儀器廠新涇分廠；ZENNIUM電化學工作站，購于德國Zahner公司；H1650離心機，購于湘儀離心機儀器有限公司。

1.3硫化鎘-石墨烯納米復合物的合成

通過改進的Hummers法[5]合成氧化石墨，以氧化石墨和硝酸鎘為原料、以硫化氫為硫源和還原劑制備硫化鎘-石墨烯納米復合物。具體制備方法為：稱取170mg所制得氧化石墨，將其加入到含有100mL蒸餾水的反應瓶中，超聲30min；在磁力攪拌下向該懸浮液中緩慢加入500mL0.02mol/L硝酸鎘溶液，常溫下攪拌3h；然后向反應瓶中通入硫化氫氣體，反應1h后將其離心分離，將所得納米材料干燥后備用。

1.4修飾電極的構建

將直徑為3.0mm的玻碳電極在使用前依次用1.0、0.3μm的三氧化二鋁拋光粉在拋光布上拋成鏡面，然后在無水乙醇中超聲清洗1min，再用雙蒸水超聲清洗1min，用氮氣吹干電極后在其表面滴涂5μL2mg/mL的硫化鎘-石墨烯納米復合物，室溫晾干后將修飾的電極浸入含有10U/mL乙酰膽堿酯酶的0.1mol/LPBS（pH值7.4）中，置于4℃冰箱中10h，然后取出電極并清洗掉弱鍵合或弱吸附的酶分子，制成修飾電極。

1.5分析方法

電化學試驗在德國ZENNIUM電化學工作站上進行，采用傳統(tǒng)的三電極體系：修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為輔助電極。循環(huán)伏安技術檢測時，先將三電極體系插入含氯化硫代乙酰膽堿的PBS溶液中檢測電流信號，然后將工作電極取出，在含有多菌靈的溶液中浸泡2min，接著把工作電極放回電解池中檢測電流信號，根據電流前后的酶抑制效率，確定多菌靈的濃度。計時電流試驗考察酶在電極上的活性時是在電磁攪拌下的PBS溶液中進行的，待加上操作電壓，背景電流達到穩(wěn)定值后，用微量注射器迅速加入一定濃度的氯化硫代乙酰膽堿溶液到電解池中，以相應的電流值作為氯化硫代乙酰膽堿的響應信號。所有測量試驗均在室溫25℃下進行。

2結果與分析

2.1硫化鎘-石墨烯復合材料固定乙酰膽堿酯酶的酶催化活性

西維因對乙酰膽堿酯酶的酶抑制效率用以下公式計算：

酶抑制效率=（1-Ip，exp/Ip，control）×100%。

式中：Ip，control為氯化硫代乙酰膽堿在工作電極上的響應峰電流；Ip，exp為工作電極在酶被抑制后的響應峰電流。

以恒電位計時電流法研究酶的催化活性。由圖1可以看出，隨著氯化硫代乙酰膽堿濃度的不斷增加，生物傳感器的電流響應呈現出Michaelis-Menten特性，其表觀Michaelis-Menten常數Km（表示酶對底物的親和力）可由電化學Lineweaver-Burk方程[6]得到。由圖2數據分析可知，吸附態(tài)乙酰膽堿酯酶的Km值為0.24mmol/L，比文獻報道的吸附在納米金溶膠-凝膠膜（0.45mmol/L）[7]和碳納米管修飾膜（4.4mmol/L）[8]上乙酰膽堿酯酶的Km值小得多，說明吸附在硫化鎘-石墨烯納米復合膜電極上的乙酰膽堿酯酶對催化底物氯化硫代乙酰膽堿具有較高的親和性和催化活性。endprint

2.2氨基甲酸酯類農藥西維因檢測方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農藥西維因對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用，可構建一種簡單、有效的用于氨基甲酸酯類農藥檢測的電化學方法。

2.3標準曲線的繪制

準確配制不同濃度的西維因標準溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進行操作，以修飾電極在西維因標準溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標，以西維因相應濃度的對數lg（西維因濃度）為橫坐標繪制標準曲線，由圖4可見，兩者呈良好的線性關系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測限為0.72ng/mL。

2.4精密度測定

對同一樣品重復測定8次，測其精確度，發(fā)現對西維因的檢測標準偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準確度測定

準確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標準品，按樣品測定方法進行測定，計算回收率，其結果見表1，可見檢測回收率在98.5%～101.3%之間。結果表明，該方法準確度高，符合農藥檢測要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對花期經過西維因處理過的黃瓜取樣，并進行電化學分析，均未檢出西維因。

3結論

以硫化鎘-石墨烯納米復合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農藥對固定在硫化鎘-石墨烯納米復合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農藥的生物傳感器。結果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對數呈良好的線性關系，其檢測下限可達0.72ng/mL，說明該傳感器具有較高的精密度和準確度。

參考文獻：

[1]伍小紅，李建科，惠偉.農藥殘留對食品安全的影響及對策[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：80-84.

[2]崔洪力，李強，劉美良.農藥殘留及監(jiān)控對策[J].農業(yè)與技術，2002，22（5）：74-76.

[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

[4]Tran-MinhC，PandeyPC，KumaranS.Studiesonacetylcholinesensoranditsanalyticalapplicationbasedontheinhibitionofcholinesterase[J].Biosensors&Bioelectronics，1990，5（6）：461-471.

[5]HummersJrWS，OffemanRE.Preparationofgraphiticoxide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1958，80（6）：1339.

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[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint

2.2氨基甲酸酯類農藥西維因檢測方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農藥西維因對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用，可構建一種簡單、有效的用于氨基甲酸酯類農藥檢測的電化學方法。

2.3標準曲線的繪制

準確配制不同濃度的西維因標準溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進行操作，以修飾電極在西維因標準溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標，以西維因相應濃度的對數lg（西維因濃度）為橫坐標繪制標準曲線，由圖4可見，兩者呈良好的線性關系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測限為0.72ng/mL。

2.4精密度測定

對同一樣品重復測定8次，測其精確度，發(fā)現對西維因的檢測標準偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準確度測定

準確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標準品，按樣品測定方法進行測定，計算回收率，其結果見表1，可見檢測回收率在98.5%～101.3%之間。結果表明，該方法準確度高，符合農藥檢測要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對花期經過西維因處理過的黃瓜取樣，并進行電化學分析，均未檢出西維因。

3結論

以硫化鎘-石墨烯納米復合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農藥對固定在硫化鎘-石墨烯納米復合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農藥的生物傳感器。結果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對數呈良好的線性關系，其檢測下限可達0.72ng/mL，說明該傳感器具有較高的精密度和準確度。

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在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農藥西維因對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用，可構建一種簡單、有效的用于氨基甲酸酯類農藥檢測的電化學方法。

2.3標準曲線的繪制

準確配制不同濃度的西維因標準溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進行操作，以修飾電極在西維因標準溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標，以西維因相應濃度的對數lg（西維因濃度）為橫坐標繪制標準曲線，由圖4可見，兩者呈良好的線性關系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測限為0.72ng/mL。

2.4精密度測定

對同一樣品重復測定8次，測其精確度，發(fā)現對西維因的檢測標準偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準確度測定

準確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標準品，按樣品測定方法進行測定，計算回收率，其結果見表1，可見檢測回收率在98.5%～101.3%之間。結果表明，該方法準確度高，符合農藥檢測要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對花期經過西維因處理過的黃瓜取樣，并進行電化學分析，均未檢出西維因。

3結論

以硫化鎘-石墨烯納米復合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農藥對固定在硫化鎘-石墨烯納米復合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農藥的生物傳感器。結果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對數呈良好的線性關系，其檢測下限可達0.72ng/mL，說明該傳感器具有較高的精密度和準確度。

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[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint