余樂(lè)+蘭芹英+姜宗慶

摘要：以鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)不同無(wú)機(jī)鹽濃度、不同培養(yǎng)溫度以及不同激素濃度配比等影響因子進(jìn)行研究，確立以種子無(wú)菌萌發(fā)為途徑的鐵皮石斛組培快繁體系。結(jié)果表明：25℃時(shí)，1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基配方最有利于鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)和幼苗分化；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基配方最適合鐵皮石斛幼苗生根，生根率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；種子；離體快繁；優(yōu)化培養(yǎng)基配方

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.23+9.04文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0268-02

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生型草本植物，別稱黑節(jié)草、鐵皮蘭，是我國(guó)特有的名貴藥材[1-3]。此外，鐵皮石斛亦有“救命仙草”“寸金草”之稱[4]，《道臧》將其譽(yù)為“中華九大仙草之首”。近年來(lái)，由于人們對(duì)石斛生存環(huán)境的過(guò)度破壞，野生石斛長(zhǎng)期處于被濫采濫挖的狀態(tài)；加上石斛自然繁殖困難，種子萌發(fā)率低，而傳統(tǒng)繁殖又較為緩慢，現(xiàn)在已經(jīng)很難發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛的蹤跡[5-10]，因而藥用石斛市場(chǎng)供需矛盾也就日益凸顯出來(lái)[11-12]。本研究以鐵皮石斛成熟種子為外植體，通過(guò)對(duì)不同無(wú)機(jī)鹽濃度、不同培養(yǎng)溫度以及不同激素濃度配比等問(wèn)題的探討，以期建立鐵皮石斛離體快繁技術(shù)體系，從而為鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)，對(duì)野生石斛的種質(zhì)資源保護(hù)也具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用鐵皮石斛成熟種子由泰州森禾花卉園藝有限公司花木基地提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子無(wú)菌萌發(fā)（1）培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)種子萌發(fā)的影響試驗(yàn)：設(shè)KC、1/2MS、1/4MS、MS等4種培養(yǎng)基，均添加2%蔗糖、0.6%瓊脂、20%馬鈴薯汁，調(diào)節(jié)pH值為5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照度2000lx，光照時(shí)間12h/d，環(huán)境濕度60%～70%。（2）培養(yǎng)溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響試驗(yàn)：設(shè)15～30℃和25/30℃變溫處理，培養(yǎng)基配方為1/2MS+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁，pH值5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照度為2000lx，光照時(shí)間為12h/d，環(huán)境濕度60%～70%。12瓶為1組，每組3個(gè)重復(fù)，30d為1個(gè)周期，觀察并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)、原球莖的生長(zhǎng)情況，選出最適宜鐵皮石斛種子無(wú)菌萌發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.2原球莖增殖與分化研究不同激素濃度配比對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖與分化的影響，培養(yǎng)基配方為：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁。調(diào)節(jié)pH值至5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx，光照時(shí)間12h/d、環(huán)境濕度60%～70%的條件下培養(yǎng)。12瓶為1組，每組3個(gè)重復(fù)，60d為1個(gè)周期，觀察并統(tǒng)計(jì)原球莖增殖與分化情況，從中選出最適宜鐵皮石斛原球莖增殖與分化的培養(yǎng)基。

1.2.3幼苗壯苗生根培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的鐵皮石斛組培苗接入配方為MS+0.1～1.0mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中。調(diào)節(jié)pH值為5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx、光照時(shí)間12h/d、環(huán)境濕度60%～70%的條件下培養(yǎng)。12瓶為1組，每組3個(gè)重復(fù)，60d為1個(gè)周期，觀察并統(tǒng)計(jì)鐵皮石斛幼苗壯苗的生根情況，篩選出適合鐵皮石斛幼苗壯苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1.2.4煉苗移栽將生長(zhǎng)良好、根系發(fā)達(dá)的鐵皮石斛組培苗于常溫下煉苗3～5d后移栽至日光溫室中。培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，環(huán)境濕度70%～80%。栽培基質(zhì)為泥炭土、碎樹(shù)皮，栽培容器為無(wú)紡布袋、塑料花盆。以50株苗為1組，每組3個(gè)重復(fù)，60d為1個(gè)周期，篩選出適合鐵皮石斛組培苗的栽培環(huán)境。

2結(jié)果與分析

2.1種子無(wú)菌萌發(fā)

2.1.1基本培養(yǎng)基的篩選由表1可以看出，鐵皮石斛種子在4種基本培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，但原球莖誘導(dǎo)效果存在差異。以1/2MS最好，1/4MS次之，MS的誘導(dǎo)效果最差；鐵皮石斛種子在1/2MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)時(shí)間較短，且萌發(fā)整齊，原球莖誘導(dǎo)率高達(dá)91.1%。實(shí)際觀察發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基上的原球莖呈鮮綠色，且粒大。綜合考慮原球莖的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)勢(shì)，1/2MS培養(yǎng)基是最適合鐵皮石斛種子無(wú)菌萌發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.1.2溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響由表2可以看出，在15℃培養(yǎng)30d后，鐵皮石斛種子沒(méi)有發(fā)生變化；在20℃條件下培養(yǎng)的種子，原球莖體積較小，呈嫩綠色，誘導(dǎo)時(shí)間比25℃、30℃和25/30℃變溫培養(yǎng)條件的長(zhǎng)；25℃條件下的種子萌發(fā)整齊一致，原球莖呈綠色，且粒大。綜上分析可知，25℃較適合鐵皮石斛種子的無(wú)菌萌發(fā)。

2.2原球莖增殖與分化

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，在鐵皮石斛組培快繁過(guò)程中作用明顯。將種子萌發(fā)后誘導(dǎo)出的原球莖接入培養(yǎng)基中，60d后觀察統(tǒng)計(jì)。表3結(jié)果表明，即使不添加任何激素，原球莖也能增殖，但增殖系數(shù)最低，增殖情況最差；適當(dāng)濃度的激素配比有利于原球莖的增殖，以添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素濃度組合的增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)到10.2，原球莖呈綠色，簇生，增殖趨勢(shì)明顯。

將已增殖的原球莖接入到誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基中，60d后觀察。表3結(jié)果表明，以添加2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素濃度組合的分化效果最好，分化出的幼苗已有細(xì)根，且仍有分化趨勢(shì)，分化率可達(dá)80.5%。

綜合表3試驗(yàn)結(jié)果可知，0.1mg/LNAA對(duì)原球莖增殖的效果較好，當(dāng)濃度升高到0.5mg/L時(shí)，增殖效果會(huì)受到抑制；2.0mg/L6-BA最有利于原球莖分化，當(dāng)濃度升高或降低時(shí)，原球莖分化效果均受到抑制。endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對(duì)鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長(zhǎng)1.9cm，鐵皮石斛苗長(zhǎng)勢(shì)一般；當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長(zhǎng)4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長(zhǎng)勢(shì)快?？偟慕Y(jié)果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個(gè)處理，可見(jiàn)適當(dāng)濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對(duì)生境要求比較苛刻，因此栽培基質(zhì)及栽培容器的選擇對(duì)移栽成活與否至關(guān)重要。由表5可以看出，碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹(shù)皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實(shí)際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗(yàn)中較為理想的組合為碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋，究其原因，是以碎樹(shù)皮為基質(zhì)、無(wú)紡布袋作為栽培容器時(shí)，通氣且排水性良好，不會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛爛根，因此生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細(xì)小，蒴果內(nèi)種子數(shù)以萬(wàn)計(jì)，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無(wú)菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達(dá)80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達(dá)，苗長(zhǎng)勢(shì)快，生根率達(dá)100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹(shù)皮作為基質(zhì)，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無(wú)紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長(zhǎng)健壯。鐵皮石斛離體快繁技術(shù)體系的建立可以有效緩解石斛市場(chǎng)供需矛盾，為鐵皮石斛種質(zhì)資源保護(hù)與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[12]林偉強(qiáng)，邊紅武，王君暉，等.鐵皮石斛類(lèi)原球莖空氣干燥法超低溫保存中的脫水蛋白分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對(duì)鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長(zhǎng)1.9cm，鐵皮石斛苗長(zhǎng)勢(shì)一般；當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長(zhǎng)4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長(zhǎng)勢(shì)快?？偟慕Y(jié)果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個(gè)處理，可見(jiàn)適當(dāng)濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對(duì)生境要求比較苛刻，因此栽培基質(zhì)及栽培容器的選擇對(duì)移栽成活與否至關(guān)重要。由表5可以看出，碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹(shù)皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實(shí)際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗(yàn)中較為理想的組合為碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋，究其原因，是以碎樹(shù)皮為基質(zhì)、無(wú)紡布袋作為栽培容器時(shí)，通氣且排水性良好，不會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛爛根，因此生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細(xì)小，蒴果內(nèi)種子數(shù)以萬(wàn)計(jì)，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無(wú)菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達(dá)80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達(dá)，苗長(zhǎng)勢(shì)快，生根率達(dá)100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹(shù)皮作為基質(zhì)，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無(wú)紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長(zhǎng)健壯。鐵皮石斛離體快繁技術(shù)體系的建立可以有效緩解石斛市場(chǎng)供需矛盾，為鐵皮石斛種質(zhì)資源保護(hù)與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

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[12]林偉強(qiáng)，邊紅武，王君暉，等.鐵皮石斛類(lèi)原球莖空氣干燥法超低溫保存中的脫水蛋白分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對(duì)鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長(zhǎng)1.9cm，鐵皮石斛苗長(zhǎng)勢(shì)一般；當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長(zhǎng)4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長(zhǎng)勢(shì)快?？偟慕Y(jié)果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個(gè)處理，可見(jiàn)適當(dāng)濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對(duì)生境要求比較苛刻，因此栽培基質(zhì)及栽培容器的選擇對(duì)移栽成活與否至關(guān)重要。由表5可以看出，碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹(shù)皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實(shí)際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗(yàn)中較為理想的組合為碎樹(shù)皮+無(wú)紡布袋，究其原因，是以碎樹(shù)皮為基質(zhì)、無(wú)紡布袋作為栽培容器時(shí)，通氣且排水性良好，不會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛爛根，因此生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細(xì)小，蒴果內(nèi)種子數(shù)以萬(wàn)計(jì)，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無(wú)菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達(dá)80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達(dá)，苗長(zhǎng)勢(shì)快，生根率達(dá)100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹(shù)皮作為基質(zhì)，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無(wú)紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長(zhǎng)健壯。鐵皮石斛離體快繁技術(shù)體系的建立可以有效緩解石斛市場(chǎng)供需矛盾，為鐵皮石斛種質(zhì)資源保護(hù)與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

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