徐亞亞+紀(jì)康+盧勁曄+蔣珊珊+郝福星

摘要：運(yùn)用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建E058ΔneuC基因缺失突變株。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果，突變株E058ΔneuC比野生株E058的生長(zhǎng)速度稍慢。在血清殺菌試驗(yàn)中，與野生株E058相比，E058ΔneuC在血清中的存活率顯著下降。體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果表明，突變株E058ΔneuC毒力被輕度的致弱。體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)中，E058ΔneuC突變株在受檢臟器中的細(xì)菌數(shù)較APECE058株均明顯下降，在心、肝、脾、腎中極顯著下降，在肺中也極顯著下降。結(jié)果表明，neuC基因與APECE058株的致病性有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：禽病源性大腸桿菌；neuC基因；突變株；致病性

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0234-03

禽大腸桿菌病由禽源性大腸桿菌引起，造成局部或全身性感染，包括大腸桿菌性蜂窩織炎（炎性過(guò)程）、Hjarre氏?。ㄈ庋磕[）、敗血癥、氣囊病、腹膜炎、滑膜炎/骨髓炎、臍炎/卵黃囊感染、腫頭綜合征、輸卵管炎、全眼球炎等，大腸桿菌病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在禽病調(diào)查中疾病是胴體報(bào)廢的主要原因，禽肉加工中43%肉雞胴體的報(bào)廢與大腸桿菌病有關(guān)[1-2]。禽病原性大腸桿菌致病相關(guān)的毒力因子已相繼報(bào)道，如Ι型菌毛、P菌毛、莢膜、脂多糖復(fù)合物、鐵攝取系統(tǒng)（氣桿菌素、鐵系統(tǒng)和耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島等）[3-4]、空泡形成毒素（vacuolatingautotransportertoxin，VAT）[5-6]、侵襲素IbeA[7]等。[LL]禽大腸桿菌病不僅有復(fù)雜的致病機(jī)理，而且部分的毒力因子功能還有待進(jìn)一步明確。

本研究從我國(guó)分離的禽病原性大腸桿菌E058株（O2血清型）在芯片雜交試驗(yàn)中獲得的表達(dá)差異片段中選取neuC基因片段為研究對(duì)象[8]，構(gòu)建E058ΔneuC突變株，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，探討基因neuC和E058株致病性之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.3主要試劑

TaqDNAPolymerase、T4連接酶、DNaseⅠ購(gòu)自Fermentas公司；dNTP、DNA限制性?xún)?nèi)切酶、DNAmarker購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCRcleanupkit、AgaroseGelDNAPurificationKit購(gòu)自杭州AXYGEN公司；SDS、NaAc、EDTA、ATP、Casaminoacids，2′，2′-dipyridyl購(gòu)自Sigma公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自BioBasic公司；Tryptone、Yeastextract為Oxoid產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品；抗生素使用濃度為：氨芐青霉素60μg/mL、卡那霉素50μg/mL。

1.1.4試驗(yàn)雞

SPF雞由北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SPF種蛋本室自行孵化。

1.2方法

1.2.1分子生物學(xué)及數(shù)據(jù)分析軟件

PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件；Lasergene序列分析軟件；GraphPadPrism5數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2.2T-neuC-Kan重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以E058野生株基因組DNA為模板，采用普通PCR擴(kuò)增neuC基因。應(yīng)用neuC-F/neuC-R引物，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定是預(yù)期大小的片段，然后用AgaroseGelDNA膠回收試劑盒回收純化DNA片段。將純化回收的neuC基因片段直接克隆入pMD·18-T載體中。采用CaCl2法按《分子克隆》所述步驟進(jìn)行將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂板，完成感受態(tài)細(xì)胞的制備，參照《分子克隆》相關(guān)步驟[9-10]進(jìn)行菌落挑取，進(jìn)行培養(yǎng)，以及提取小量的質(zhì)粒；提取質(zhì)粒后再進(jìn)行BamHⅠ-HindⅢ雙酶切的鑒定，鑒定正確即為重組質(zhì)粒T-neuC。設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物T-neuC-F的5′端引入EcoRⅠ位點(diǎn)；下游引物T-neuC-R的5′端引入EcoRⅠ位點(diǎn)。上、下游引物擴(kuò)增片段約為3.2kb。以重組質(zhì)粒T-neuC為模板，反向PCR擴(kuò)增T-neuC片段。將純化回收反向擴(kuò)增的T-neuC片段和pUC4K質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切。將回收的反拉T-neuC片段與酶切下來(lái)的Kan片段連接。將連接產(chǎn)物涂板，再挑取菌落、培養(yǎng)和質(zhì)粒的小量提取等，質(zhì)粒提取后分別用EcoRⅠ酶切鑒定，電泳鑒定，正確的質(zhì)粒委托專(zhuān)業(yè)檢測(cè)公司完成測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序鑒定正確的即為重組質(zhì)粒T-neuC-Kan。

1.2.2電轉(zhuǎn)化親本株E058構(gòu)建突變株E058ΔneuC

將PCR擴(kuò)增的T-neuC-Kan片段電轉(zhuǎn)化到含有感受態(tài)細(xì)胞的E058中，通過(guò)Red重組系統(tǒng)構(gòu)建突變株E058ΔneuC。

1.3細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將野生株E058和突變株E058ΔneuC在LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，加入10mL的LB液體培養(yǎng)基中（調(diào)節(jié)D600nm=0.05）。以220r/min條件在37℃恒溫?fù)u床中搖振培養(yǎng)；連續(xù)4h，每隔30min測(cè)定細(xì)菌的D600nm，繪制野生株和突變株的生長(zhǎng)曲線，并對(duì)野生株與突變株的生長(zhǎng)速度進(jìn)行觀察。

1.4SPF雞血清的殺菌性試驗(yàn)

采集SPF雞血清并充分混勻，儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆?。將混勻的血清用pH值7.2的PBS緩沖液稀釋為0.5%、2.5%、5%、12.5%、25%的血清懸液，以及1份25%的滅能血清（56℃金屬浴30min滅能）。取10μL菌液（含有106CFU的細(xì)菌）分別加到190μL血清懸液以及滅能血清中，37℃培養(yǎng)30min。取出，在普通LB平板上進(jìn)行細(xì)菌掛板計(jì)數(shù)，18h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量。

1.5體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

將細(xì)菌的濃度調(diào)至1×108CFU/mL，E058野生株與E058ΔneuC突變株各自以1∶1的比例混合均勻，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)4h。然后分別用無(wú)抗性的LB平板和含有kanamycin抗性的LB平板對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)，18h后可以觀察到結(jié)果。競(jìng)爭(zhēng)指數(shù)（CI）的公式計(jì)算方法是：輸出量的比率（突變株/野生株）除以輸入量的比率（突變株/野生株）。若CI值在0.1～1.0之間，表明突變株毒力被輕度致弱；如CI值在0.01～0.10之間，表明突變株毒力被中度致弱；若如CI值在0～0.01之間表明突變株毒力被高度致弱[11]。endprint

1.6體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)

將細(xì)菌濃度調(diào)至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機(jī)分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對(duì)照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱(chēng)重后研磨，經(jīng)過(guò)稀釋后用無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基、kanamycin抗性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，18h后觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經(jīng)引物neuC-F/neuC-R擴(kuò)增出1700bp的條帶，而親本株E058擴(kuò)增出900bp的條帶。與預(yù)期的結(jié)果相一致。

2.2生長(zhǎng)曲線

從生長(zhǎng)曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長(zhǎng)速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗(yàn)中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時(shí)突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競(jìng)爭(zhēng)

對(duì)E058、E058ΔneuC株分別細(xì)菌計(jì)數(shù)至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4h。在有、無(wú)抗性的LB平板上，根據(jù)其計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結(jié)果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布結(jié)果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達(dá)極顯著水平。

3結(jié)論

禽大腸桿菌作為家禽最常見(jiàn)的病原菌之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關(guān)的毒力因子已經(jīng)相繼報(bào)道。然而許多毒力因子是通過(guò)一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過(guò)程中間環(huán)節(jié)的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關(guān)，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個(gè)區(qū)域，其中區(qū)域1、區(qū)域3主要負(fù)責(zé)將細(xì)菌胞內(nèi)的高分子聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，區(qū)域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關(guān)聯(lián)。而neuC基因在區(qū)域2中，莢膜能保護(hù)菌體免受宿主免疫機(jī)制的侵害以及降低巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建的E058ΔneuC突變株開(kāi)展了多項(xiàng)相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關(guān)系。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，E058ΔneuC突變株的生長(zhǎng)速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達(dá)到顯著的差異水平；體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內(nèi)的細(xì)菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進(jìn)而說(shuō)明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強(qiáng)的關(guān)系，并與芯片雜交結(jié)果相一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]CalnekWB.禽病學(xué)[M].10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[2]甘孟侯.中國(guó)禽病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[3]HarryEG，ChubbLG.RelationshipsbetweencertainbiochemicalcharacteristicsandpathologicalactivityinavianstrainsofE.coli[J].JournalofComparativePathology，1964，74：180-187.

[4]LloydAL，RaskoDA，MobleyHL.Defininggenomicislandsanduropathogen-specificgenesinuropathogenicEscherichiacoli[J].JournalofBacteriology，2007，189（9）：3532-3546.

[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

[6]NavehMW，ZusmanT，SkutelskyE，etal.AdherencepiliinavianstrainsofEscherichiacoli：effectonpathogenicity[J].AvianDiseases，1984，28（3）：651-661.

[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周瓊，趙李祥，等.應(yīng)用DNA芯片技術(shù)研究體外表達(dá)禽致病性大腸桿菌可能致病基因[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（1）：103-111.

[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)

將細(xì)菌濃度調(diào)至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機(jī)分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對(duì)照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱(chēng)重后研磨，經(jīng)過(guò)稀釋后用無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基、kanamycin抗性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，18h后觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經(jīng)引物neuC-F/neuC-R擴(kuò)增出1700bp的條帶，而親本株E058擴(kuò)增出900bp的條帶。與預(yù)期的結(jié)果相一致。

2.2生長(zhǎng)曲線

從生長(zhǎng)曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長(zhǎng)速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗(yàn)中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時(shí)突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競(jìng)爭(zhēng)

對(duì)E058、E058ΔneuC株分別細(xì)菌計(jì)數(shù)至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4h。在有、無(wú)抗性的LB平板上，根據(jù)其計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結(jié)果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布結(jié)果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達(dá)極顯著水平。

3結(jié)論

禽大腸桿菌作為家禽最常見(jiàn)的病原菌之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關(guān)的毒力因子已經(jīng)相繼報(bào)道。然而許多毒力因子是通過(guò)一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過(guò)程中間環(huán)節(jié)的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關(guān)，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個(gè)區(qū)域，其中區(qū)域1、區(qū)域3主要負(fù)責(zé)將細(xì)菌胞內(nèi)的高分子聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，區(qū)域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關(guān)聯(lián)。而neuC基因在區(qū)域2中，莢膜能保護(hù)菌體免受宿主免疫機(jī)制的侵害以及降低巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建的E058ΔneuC突變株開(kāi)展了多項(xiàng)相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關(guān)系。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，E058ΔneuC突變株的生長(zhǎng)速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達(dá)到顯著的差異水平；體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內(nèi)的細(xì)菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進(jìn)而說(shuō)明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強(qiáng)的關(guān)系，并與芯片雜交結(jié)果相一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]CalnekWB.禽病學(xué)[M].10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

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[5]Dho-MoulinM，vandenBoschJF，GirardeauJP，etal.SurfaceantigensfromEscherichiacoliO2andO78strainsofavianorigin[J].InfectionandImmunity，1990，58（3）：740-745.

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[7]WhittamTS，WilsonRA.GeneticrelationshipsamongpathogenicstrainsofavianEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，1988，56（9）：2458-2466.

[8]宦海霞，周瓊，趙李祥，等.應(yīng)用DNA芯片技術(shù)研究體外表達(dá)禽致病性大腸桿菌可能致病基因[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（1）：103-111.

[9]GaoS，LiuXF，ZhangRK，etal.TheisolationandidentificationofpathogenicEscherichiacoliisolatesofchickenoriginfromsomeregionsinChina[J].ActaVeterinariaetZootechnicalSinica，1999，30：164-171.

[10]LiG，LaturnusC，EwersC，etal.IdentificationofgenesrequiredforavianEscherichiacolisepticemiabysignaturetaggedmutagenesis[J].InfectionandImmunity，2005，73：2818-2827.

[11]RussoTA，McFaddenCD，Carlino-MacDonaldUB，etal.IroNfunctionsasasiderophorereceptorandisaurovirulencefactorinanextraintestinalpathogenicisolateofEscherichiacoli[J].InfectionandImmunity，2002，70：7156-7160.

[12]KaijserB，HansonLA，JodalV，etal.FrequencyofE.coliKantigensinurinary-tractinfectionsinchildren[J].Lancet，1977，1：664-666.

[13]RobertsIS.Bacterialpolysaccharidesinsicknessandinhealth[J].Microbiology，1995，141（9）：2023-2031.endprint

1.6體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)

將細(xì)菌濃度調(diào)至1×108CFU/mL，45羽35日齡的SPF雞，隨機(jī)分為3組，每組15羽，其中2組分別于左胸的氣囊接種0.25mL的E058野生株和E058ΔneuC突變株，還有1組為空白對(duì)照。接種24h后，全部撲殺，取心血及肝、脾、肺、腎，稱(chēng)重后研磨，經(jīng)過(guò)稀釋后用無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基、kanamycin抗性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，18h后觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1突變株E058ΔneuC的鑒定

突變株E058ΔneuC經(jīng)引物neuC-F/neuC-R擴(kuò)增出1700bp的條帶，而親本株E058擴(kuò)增出900bp的條帶。與預(yù)期的結(jié)果相一致。

2.2生長(zhǎng)曲線

從生長(zhǎng)曲線上可以看出E058ΔneuC比野生株E058的生長(zhǎng)速度稍慢（圖1）。

2.3血清殺菌

在血清殺菌試驗(yàn)中，血清濃度從低到高分別為0.50%、2.50%、5.00%、12.50%、25.00%，“HI”代表的是25%的滅活血清。從圖2可以看出血清濃度為5%、12.50%、25%時(shí)突變株E058ΔneuC被輕度致弱。

2.4體外競(jìng)爭(zhēng)

對(duì)E058、E058ΔneuC株分別細(xì)菌計(jì)數(shù)至1×108CFU，分別將等量的E058ΔneuC與E058混合于2mLLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4h。在有、無(wú)抗性的LB平板上，根據(jù)其計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算得到E058ΔneuC和E058的CI值為0.65。結(jié)果表明，在體外突變株E058ΔneuC毒力被輕度致弱。

2.5體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布結(jié)果，與E058相比，突變株E058ΔneuC的毒力極顯著被致弱（圖3）。接種24h后，親本株E058在心臟細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、在肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2×104CFU/ml、2.3×104、1.9×105、2.0×105、7.8×104CFU/g；而突變株在心臟、肝、脾、肺、腎中的細(xì)菌檢出數(shù)量為1.2CFU/mL、0.9、3.4、15、1.3CFU/g，兩者差異達(dá)極顯著水平。

3結(jié)論

禽大腸桿菌作為家禽最常見(jiàn)的病原菌之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然禽大腸桿菌和致病力相關(guān)的毒力因子已經(jīng)相繼報(bào)道。然而許多毒力因子是通過(guò)一系列的感染模型被證明。在自然條件下，大腸桿菌感染動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理尚未完全清楚，已知致病因子僅能用于解釋感染過(guò)程中間環(huán)節(jié)的某些步驟。

NeuC基因與莢膜形成有關(guān)，而莢膜是大腸桿菌中重要的毒力因子之一[12]。莢膜有3個(gè)區(qū)域，其中區(qū)域1、區(qū)域3主要負(fù)責(zé)將細(xì)菌胞內(nèi)的高分子聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，區(qū)域2跟莢膜的形成、激活、聚合等相關(guān)聯(lián)。而neuC基因在區(qū)域2中，莢膜能保護(hù)菌體免受宿主免疫機(jī)制的侵害以及降低巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬[13]。

本研究中利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建的E058ΔneuC突變株開(kāi)展了多項(xiàng)相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了致病性，研究基因neuC和APECE058株致病性的關(guān)系。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，E058ΔneuC突變株的生長(zhǎng)速度稍慢。不同濃度的SPF雞血清中的E058ΔneuC突變株的存活能力有所下降，特別是濃度從5%～25%的雞血清中，與親本株比較達(dá)到顯著的差異水平；體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中突變株的CI值都在0.1～1.0之間，突變株輕度致弱；體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果，E058ΔneuC突變株在受檢臟器內(nèi)的細(xì)菌較APECE058株均有不同程度的下降，表明突變株定植于各受檢臟器的能力減弱，進(jìn)而說(shuō)明突變株的毒力減弱。

綜上所述，NeuC基因與APECE058株致病性有較強(qiáng)的關(guān)系，并與芯片雜交結(jié)果相一致。

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