任春梅+程兆榜+朱慧+邰麗娟+陸鳳霞+鮑傳華+范永堅(jiān)+周益軍

摘要：采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸銫密度梯度離心，得到提純的3種麥類土傳花葉病毒（小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、中國小麥花葉病毒）。透射電鏡觀察分別可見線狀、直桿狀病毒粒子，測定濃度分別達(dá)5.44、8.08、4.09mg/mL。提純病毒免疫新西蘭大白兔制備抗血清，得到的3株抗血清經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定效價(jià)分別達(dá)1∶12800、1∶25600、1∶6400。應(yīng)用樣品和多抗稀釋的方陣試驗(yàn)，建立3種多抗的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法（TAS-ELISA），并對(duì)采自江蘇省、安徽省、河南省、山東省的麥子病樣進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陽性檢出率較高，說明這3種病毒仍是我國麥子流行的主要病毒。

關(guān)鍵詞：小麥黃花葉病毒；大麥黃花葉病毒；中國小麥花葉病毒；抗血清制備；血清學(xué)檢測

中圖分類號(hào)：S435.121.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0143-03

小麥黃花葉病毒（wheatyellowmosaicvirus，WYMV）、大麥黃花葉病毒（barleyyellowmosaicvirus，BaYMV）、中國小麥花葉病毒（Chinesewheatmosaicvirus，CWMV）是3種典型的麥類土傳病毒，其引起的麥類土傳病害嚴(yán)重影響麥子的產(chǎn)量及品質(zhì)，三者均由土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxagraminis）傳播，前兩者屬于大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus），CWMV屬于真菌傳桿狀病毒屬（Furovirus）[1]。WYMV主要分布于日本、韓國、中國[2]，BaYMV主要分布在日本、西北歐、中國，近年來在我國長江中下游及淮河地區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重[3-4]。分子生物學(xué)檢測技術(shù)靈敏度高但操作繁瑣且花費(fèi)大，血清學(xué)方法操作簡單且一次性可以處理大量樣品而應(yīng)用較為廣泛，但其核心抗體價(jià)格比較昂貴且質(zhì)量要求比較高。本研究以提純的3種麥類土傳病毒的病毒粒子為抗原，制備3種病毒的多克隆抗體，并以制備的抗體建立了3種病毒的TAS-ELISA方法，對(duì)田間樣品進(jìn)行了檢測應(yīng)用，旨在為此類病毒診斷、抗病品種選育等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

WYMV、CWMV、BaYMV來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)病圃中有典型癥狀的小麥、大麥葉片，病圃原始病土分別來源于江蘇省高郵市（WYMV）、江蘇省鹽城市（BaYMV）、江蘇省大豐市（CWMV），病葉-20℃保存。RSV、RBSDV毒源由筆者所在實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。試驗(yàn)用兔為飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所兔場的新西蘭大白兔。弗氏佐劑購于Sigma公司。堿性磷酸酯酶標(biāo)記的第二抗體購于美國Agdia公司。超純蔗糖、硫酸銫購于上海生工生物有限公司。BeckmanOptimaL-100XP超速離心機(jī)，其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1病毒的提純

取小麥、大麥3種病毒病葉各400g，剪碎加3×抽提緩沖液，攪拌機(jī)攪碎，2層紗布過濾。加1/4濾液體積的CCl4，冰浴攪拌5min，靜置10min，8000r/min離心15min。取上清，加6%PEG-6000、3%NaCl、1%TritonX-100，冰浴攪拌至全部溶解，4℃下放置6h或過夜。8000r/min離心20min，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，10000r/min離心15min，取上清。上清加5mL30%蔗糖墊（含0.3%TritonX-100），25000r/min離心2h。沉淀用懸浮緩沖液懸浮，12000r/min離心10min，取上清。采用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心法進(jìn)一步純化，22000r/min離心3h。離心管上端1/3處為病毒層，用樣品緩沖液稀釋，40000r/min離心1h。用0.5mL樣品緩沖液懸浮沉淀，得到提純病毒液，取20μL4℃保存，用于電鏡檢測；另取480μL-20℃保存。

1.2.2病毒的電鏡觀察及紫外檢測

提純病毒液經(jīng)適當(dāng)稀釋，取1滴滴于Parafilm膜上，取有支持膜的銅網(wǎng)，膜向下置于液滴表面，放置數(shù)分鐘，挾起銅網(wǎng)，從銅網(wǎng)邊緣吸去余液，似干未干之時(shí)將膜向下置于2%磷鎢酸液（PTA）滴上染色30s至2min，吸干余液，置于JEOLJEM-1200E-X電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。以pH值為7.2的0.01mol/LPB緩沖液為參照，用該緩沖液稀釋病毒液再用紫外分光光度計(jì)測D260nm、D280nm值，計(jì)算病毒濃度、產(chǎn)量[5]。

1.2.3抗血清制備

于試驗(yàn)前1周到兔場選取體質(zhì)量約2kg的健康新西蘭大白兔公兔6只，每種病毒用2只，編號(hào)分別為W1和W2、Ba1和Ba2、C1和C2，于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)觀察1周以度過應(yīng)激反應(yīng)期。兔免疫前取耳緣靜脈2mL左右血液作為健康血清。免疫分6次進(jìn)行，每隔1周注射1次，第1、第2、第3次采取大腿2點(diǎn)及背部皮下多點(diǎn)注射，注射所用病毒劑量為0.5mg；第3次注射結(jié)束10d后，取0.5mg病毒分別加強(qiáng)免疫，采用耳緣靜脈注射，連續(xù)免疫3次，每次間隔1周。第1次注射用等體積完全佐劑充分乳化，后面5次用等體積不完全佐劑充分乳化。最后1次免疫10d后預(yù)采血進(jìn)行效價(jià)測定，達(dá)到要求后進(jìn)行大量采血。取血前1d晚上停止喂食，只少量飲水。采用心臟采血方式，每次取血完后將血漿放入滅菌培養(yǎng)皿中，室溫下放置2h，移入4℃冰箱擺成斜面放置過夜。吸取血清，6000r/min離心10min，棄殘余血球沉淀，上清即為抗血清[6]。

1.2.4抗血清效價(jià)測定

第6次免疫后第10天預(yù)采血2mL，采用TAS-ELISA法[7]測定抗血清效價(jià)?？寡灏?/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600、1/51200、1/102400、1/204800梯度進(jìn)行稀釋，同時(shí)取注射前的血清（本底血清）按同樣的梯度進(jìn)行稀釋作為陰性對(duì)照，取包被液作為空白對(duì)照，試驗(yàn)組及對(duì)照組每個(gè)稀釋度均做3個(gè)平行。

1.2.5抗血清特異性評(píng)價(jià)

對(duì)3種病毒的抗血清進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。經(jīng)鑒定單獨(dú)感染RSV、RBSDV、WYMV、BaYMV、CWMV等5種病毒的病葉用0.05mol/L包被緩沖液（pH值為9.6）稀釋20倍包被ELISA板，分別以3種病毒的免疫原作為陽性對(duì)照，健康葉汁為陰性對(duì)照，每處理重復(fù)3次，采用TAS-ELISA法測定3種抗血清的特異性。

1.2.6TAS-ELISA最適條件確定

采用方陣試驗(yàn)對(duì)3種病毒的抗血清進(jìn)行TAS-ELISA最適條件測定。酶標(biāo)板縱向從上而下，用pH值為9.6的碳酸緩沖液從1∶156.25至1∶20000倍比稀釋3種多抗，酶標(biāo)板橫向從左至右用樣品緩沖液以1∶10～1∶5120倍比稀釋，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為5000倍，分別以3種病毒為陽性對(duì)照（病毒稀釋80倍，抗體同上倍比稀釋），健康葉汁為陰性對(duì)照（葉片同上倍比稀釋，抗體156.25倍稀釋），每處理設(shè)3次重復(fù)，P/N>2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)?；凇?.2.5”節(jié)中同屬的WYMV與BaYMV抗血清有輕微的血清學(xué)交叉反應(yīng)，作TAS-ELISA最適條件測定時(shí)，僅攜帶WYMV的樣品同上倍比稀釋，用BaYMV抗體同上倍比稀釋進(jìn)行檢測，陽性及陰性對(duì)照設(shè)置同上，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。僅攜帶BaYMV的樣品用WYMV抗體采用同上處理方式進(jìn)行檢測，以尋找避開2種抗血清交叉反應(yīng)的檢測樣品及各自抗血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.7抗血清的檢測應(yīng)用

利用3種病毒抗血清的TAS-ELISA方法對(duì)大麥、小麥樣品進(jìn)行檢測，在江蘇省高郵市、寶應(yīng)市、儀征市、常州市、泰州市姜堰區(qū)、興化市、鹽城市鹽都區(qū)、淮安市、大豐市，安徽省壽縣及來安縣，河南省遂平縣，山東省臨沂市、泰安市、濟(jì)寧市等地的大麥、小麥中采集3種病毒疑似樣品，用溫室生長的大麥、小麥健康葉片作陰性對(duì)照，病圃中經(jīng)檢測為3種病毒的病葉為陽性對(duì)照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以P/N>2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.13種提純病毒的電鏡觀察及濃度檢測

提純的3種病毒經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后在透射電鏡下觀察（圖1），3種病毒經(jīng)蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心后均有較純且濃密的病毒粒子，同屬的WYMV、BaYMV可見直線狀或彎線狀病毒粒子，粒子長度達(dá)200nm以上，WYMV粒子比BaYMV粒子長；CWMV為直桿狀病毒粒子，粒子長度100～300nm，直徑約為20nm。用紫外分光光度法測得提純病毒濃度分別為5.44mg/mL（WYMV）、8.08mg/mL（BaYMV）、4.09mg/mL（CWMV）。

2.23種病毒抗血清效價(jià)的測定

分別獲得2株抗血清，以間接ELISA法測定2株抗血清的效價(jià)。由圖2可知，免疫前的本底血清在3種病毒免疫反應(yīng)中都較弱，制備的3種抗血清分別在稀釋12800倍（WYMV）、25600倍（BaYMV）、6400倍（CWMV）下仍有明顯的血清學(xué)反應(yīng)，表明三者的抗血清效價(jià)分別達(dá)1∶12800、1∶25600、1∶6400，3種抗血清均可用于后續(xù)免疫學(xué)試驗(yàn)。

2.33種病毒抗血清特異性評(píng)價(jià)

由表1可知，同屬大麥黃花葉病毒屬的WYMV與BaYMV有弱的血清學(xué)交叉反應(yīng)，2種病毒的抗血清與CWMV、RSV、RBSDV反應(yīng)均較弱。CWMV抗血清特異性較強(qiáng)，除自身病毒外，與其他4種病毒的反應(yīng)均接近于健康植株的反應(yīng)。

2.43種抗血清的TAS-ELISA方法建立

方陣試驗(yàn)結(jié)果表明，作包被的3種多抗血清倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測定，WYMV、BaYMV、CWMV多抗分別在1∶10000、1∶20000、1∶5000稀釋度下，P/N值均大于2.1。3種病毒的樣品稀釋度為1∶10～1∶640時(shí)都較理想，當(dāng)稀釋度為1∶1280時(shí)，P/N值小于2.1，可以確定1∶640為檢測極限稀釋度。考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)檢測靈敏度較高，初步確定3種病毒樣品稀釋度都選擇1∶160，多抗稀釋度分別選擇1∶5000（WYMV）、1∶10000（BaYMV）、1∶2500（CWMV）作為TAS-ELISA的最適工作濃度。表2顯示，BaYMV樣品稀釋80倍、WYMV多抗稀釋5000～10000倍時(shí)，病樣的吸光度約為健樣的2倍，說明抗體稀釋5000倍是臨界值。表3顯示，當(dāng)WYMV樣品稀釋160倍時(shí)，BaYMV多抗稀釋度為10000倍時(shí)是臨界值。由此可知，WYMV、BaYMV樣品適度為160倍，抗體稀釋度分別選擇1∶8000、1∶12000。

2.53種病毒抗血清的檢測應(yīng)用

應(yīng)用3種抗血清的TAS-ELISA檢測方法，對(duì)采自全國4個(gè)省16個(gè)縣（市、區(qū)）的60個(gè)樣品進(jìn)行檢測。由表4可知，WYMV分布最為廣泛，除了在江蘇省鹽城市的大麥及淮安市、大豐市2地的小麥樣品中均未檢到外，其余縣市均有分布，陽性檢出率在20%以上。CWMV不僅在大豐市、淮安市2個(gè)老病區(qū)的樣品上檢測到，而且在興化市的樣品中也檢測到，興化市樣品中有1株還存在WYMV與CWMV復(fù)合侵染的情況。鹽城市的大麥樣品上均為BaYMV，說明這3種病毒仍是麥類較為流行的病毒。大麥樣品中均未檢測到WYMV，小麥樣品中也未檢出BaYMV，說明應(yīng)用筆者建立的TAS-ELISA檢測方法可以有效避免2種抗血清的交叉反應(yīng)。

3結(jié)論與討論

WYMV、BaYMV、CWMV都是由禾谷多黏菌傳播的。禾谷多黏菌是1種專性寄生于植物根部的低等真核生物，本身沒有致病性，但是可以傳播多種禾谷類作物病毒，引起禾谷類作物嚴(yán)重減產(chǎn)。此類病毒在病葉中的含量很低，較難提純，主要原因是組織搗爛時(shí)病毒粒子容

易斷裂，且提純過程中病毒粒子容易聚集、不易懸浮、易丟失等。筆者選用PEG沉淀法，先用CCl4分離植物與病毒蛋白，用聚乙二醇沉淀病毒，懸浮液中加入0.1%巰基乙醇與0.3%TitonX-100，有效地解決病毒易聚集的問題。采用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度法提純病毒，克服了蔗糖密度梯度難以成帶的問題，結(jié)果表明，采用此法提純病毒時(shí)梯度離心后管中出現(xiàn)1條非常明顯的病毒帶，此帶經(jīng)進(jìn)一步離心后得到濃度高且較純的病毒，3種提純

病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進(jìn)一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經(jīng)測定，制備的3種抗血清效價(jià)分別達(dá)1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強(qiáng)，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學(xué)交叉反應(yīng)，為了避免檢測中出現(xiàn)假陽性問題，筆者對(duì)檢測樣品及抗體進(jìn)行倍比稀釋方陣試驗(yàn)，確定了能夠避免交叉反應(yīng)的稀釋倍數(shù)，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對(duì)田間樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關(guān)抗體的報(bào)道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價(jià)也不同。應(yīng)用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對(duì)田間樣品檢測結(jié)果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個(gè)縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對(duì)江蘇省小麥的危害仍然存在。

參考文獻(xiàn)：

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病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進(jìn)一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經(jīng)測定，制備的3種抗血清效價(jià)分別達(dá)1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強(qiáng)，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學(xué)交叉反應(yīng)，為了避免檢測中出現(xiàn)假陽性問題，筆者對(duì)檢測樣品及抗體進(jìn)行倍比稀釋方陣試驗(yàn)，確定了能夠避免交叉反應(yīng)的稀釋倍數(shù)，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對(duì)田間樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關(guān)抗體的報(bào)道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價(jià)也不同。應(yīng)用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對(duì)田間樣品檢測結(jié)果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個(gè)縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對(duì)江蘇省小麥的危害仍然存在。

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病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進(jìn)一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經(jīng)測定，制備的3種抗血清效價(jià)分別達(dá)1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強(qiáng)，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學(xué)交叉反應(yīng)，為了避免檢測中出現(xiàn)假陽性問題，筆者對(duì)檢測樣品及抗體進(jìn)行倍比稀釋方陣試驗(yàn)，確定了能夠避免交叉反應(yīng)的稀釋倍數(shù)，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對(duì)田間樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關(guān)抗體的報(bào)道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價(jià)也不同。應(yīng)用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對(duì)田間樣品檢測結(jié)果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個(gè)縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對(duì)江蘇省小麥的危害仍然存在。

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