李葵花+高玉亮+吳京姬

摘要：利用擬南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）進行了馬鈴薯品種“東農(nóng)303”的遺傳轉(zhuǎn)化，在鹽和干旱脅迫下研究轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性。經(jīng)PCR擴增，證實P5CS基因已整合到馬鈴薯基因組中。用150mmol/LNaCl溶液和干旱（基質(zhì)含水量為20%～25%）脅迫處理20d，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片的脯氨酸含量顯著增加，SOD活性明顯上升，而丙二醛積累量則緩慢，從而說明該品種更適合生長在干旱和鹽脅迫條件下。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；P5CS基因；耐鹽性；抗旱性；SOD；丙二醛

中圖分類號：S532.03文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0131-03

在干旱和鹽堿土壤等逆境條件下生長的農(nóng)作物，因受到滲透脅迫而嚴重影響其新陳代謝，造成大幅減產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，全球干旱、半干旱地區(qū)約占陸地面積的34.9%，在我國，由于干旱引起的主要農(nóng)作物減產(chǎn)量約為總產(chǎn)量的50%，鹽堿地面積則高達9913.3萬hm2，且有增加趨勢[1-2]。植物體在一定范圍的干旱和鹽堿脅迫下，大量合成并積累脯氨酸、甜菜堿等有機化合物來調(diào)節(jié)滲透壓，降低水勢，完全或部分地維持細胞膨壓，從而保證植物體內(nèi)生理生化過程的順利進行[3-4]。在滲透脅迫下脯氨酸主要來源于谷氨酸合成途徑，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase，P5CS）是脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，催化谷氨酸磷酸化并還原谷氨酸-γ-半醛，同時P5CS活性又受到脯氨酸的反饋調(diào)節(jié)。P5CS基因可被干旱、高鹽和脫落酸誘導(dǎo)表達，對高溫或低溫誘導(dǎo)沒有反應(yīng)[5]。過量表達P5CS基因的煙草植株在干旱和鹽脅迫下大量積累脯氨酸來維持其滲透壓，在400mmol/L的鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草植株根的干物質(zhì)量增加[6]；轉(zhuǎn)P5CS基因水稻實生1代的組織培養(yǎng)苗在100mmol/LNaCl脅迫下植株高度、鮮質(zhì)量比對照植株均有明顯增加；轉(zhuǎn)豇豆P5CS基因水稻實生1代在田間干旱條件下積累大量脯氨酸，生長勢明顯優(yōu)于對照植株，表明水稻實生1代可穩(wěn)定表達外源P5CS基因，并具有抗干旱、抗鹽堿能力[7]。在250mmol/L鹽脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS基因水稻細胞系的鮮重比野生型高6～8倍，其脯氨酸含量為對照的241%[8]；轉(zhuǎn)擬南芥P5CS基因大豆在干旱脅迫下能夠快速積累脯氨酸，提高抗旱性；在正常供水條件下，轉(zhuǎn)P5CS基因柑橘的脯氨酸含量與對照無明顯差異，而在水分脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸積累量明顯高于對照，抗旱性得到了較大增強[9]。上述試驗均證明P5CS基因的轉(zhuǎn)入能提高植物的抗逆性。

目前，我國東北地區(qū)土壤鹽堿化面積日漸擴大，旱澇等非生物脅迫逆境環(huán)境也頻繁發(fā)生，開發(fā)適合栽培于逆境土壤的抗旱、抗鹽堿等抗逆性作物勢在必行。馬鈴薯是常見的糧菜間作作物，生育期短、適應(yīng)性強、產(chǎn)量高，具有較好的經(jīng)濟效益。本研究把擬南芥P5CS基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種“東農(nóng)303”中，并在干旱和鹽堿脅迫環(huán)境下測定了轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)脯氨酸、丙二醛的含量及SOD活性，為選育抗旱耐鹽的馬鈴薯新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1遺傳轉(zhuǎn)化受體材料及菌株

將消毒的“東農(nóng)303”馬鈴薯微型薯切成10.0mm×10.0mm×1.5mm大小的薄片作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料；菌株為含有pCAM-BIA-1301-P5CS質(zhì)粒的LBA4404根癌農(nóng)桿菌，由筆者所在實驗室保存。

1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化

將受體材料浸泡于LBA4404農(nóng)桿菌懸浮液（吸光度D600nm=0.3）20min，共侵染1000個外植體。侵染外植體置于再分化培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+5.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+30g/L蔗糖+500mg/L羧芐青霉素+6mg/L潮霉素）中，在25℃、16h/d光照條件下培養(yǎng)，每15d繼代1次。外植體在再分化培養(yǎng)基中約4周開始分化出芽，當(dāng)再生芽長到20mm高度時，繼代到抗性生根培養(yǎng)基上（MS基本培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+500mg/L羧芐青霉素+10mg/L潮霉素），統(tǒng)計遺傳轉(zhuǎn)化率（遺傳轉(zhuǎn)化率=再生抗性植株/侵染外植體總數(shù)×100%）。

1.3PCR檢測

取抗性植株葉片，用CTAB法提取植物總DNA，以引物P5CS-F（5′-GTTTTTGAATCCCGGCCTGA-3′）和P5CS-R（5′-TCCACTTGGCGGAGGAATAT-3′）檢測P5CS基因。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；于72℃延伸7min，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4脅迫處理材料培養(yǎng)

當(dāng)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因試管苗長至8～10張葉時，將其切成莖段（帶1～2張葉）后接入MS+30g/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，在25℃、光強2000lx、光照時間16h/d條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)20d后將生根試管苗從培養(yǎng)基中取出栽植到含等量腐殖土和草炭土的營養(yǎng)缽中，每營養(yǎng)缽栽1株。將這些營養(yǎng)缽置于玻璃溫室內(nèi)，每隔2d澆透水。20d后當(dāng)植株長至約15cm時，用于脅迫處理。

1.5鹽和干旱脅迫處理

分別選取30株在營養(yǎng)缽中生長20d的長勢一致的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株，每天08：00進行脅迫處理。鹽脅迫：每隔2d澆1次150mmol/LNaCl溶液，每次澆灌500mL/缽，處理7次，隨機選取培養(yǎng)20d的植株中間同一部位的葉片用于耐鹽性鑒定。干旱脅迫：干旱脅迫處理開始前2d停止?jié)菜?，使基質(zhì)處于含水量為20%～25%的干旱條件，并維持干旱條件20d，隨機選取脅迫處理植株的中間同一部位葉片進行抗旱性鑒定。鹽脅迫和干旱脅迫分別處理5株，3次重復(fù)，同時觀察植株生長勢。

1.6耐鹽性和抗旱性鑒定

采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛（MDA）含量，茚三酮比色法測定脯氨酸含量，核黃素-NBT法測定SOD活性。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行Duncans多重比較（P<0.05）檢驗顯著性，采用Excel2007軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1抗性植株的PCR檢測

用6mg/L潮霉素篩選農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的再生抗性芽，共獲得3個抗性株系，遺傳轉(zhuǎn)化效率為0.3%。把抗性芽繼代至抗性生根培養(yǎng)基（含10mg/L潮霉素）中，其中1個株系生長正常，另2個株系生長較緩慢；對正常生長株系進行大量擴繁。用CTAB法提取葉片總DNA進行PCR檢測，擴增產(chǎn)物電泳分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與陽性質(zhì)粒均擴增出701bp相同大小的特異條帶（圖1），而非轉(zhuǎn)基因植株則無此特異條帶，證明P5CS基因已整合到再生抗性馬鈴薯植株中。

2.2耐鹽性和抗旱性

2.2.1游離脯氨酸含量

植物在高鹽、干旱等逆境下會大量積累游離脯氨酸來降低滲透脅迫所造成的氧傷害，保護脅迫下的植物體，因此，在相同脅迫條件下，同品種馬鈴薯植株中脯氨酸積累量越多，表明其抗逆性越強。圖2表示轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株在150mmol/LNaCl脅迫和基質(zhì)含水量為20%～25%的干旱脅迫下葉片中游離脯氨酸的含量。從圖2可知，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株在鹽和干旱脅迫下均有脯氨酸積累，尤其是在鹽脅迫下積累了大量脯氨酸；鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量分別為非轉(zhuǎn)基因植株的1.7倍和1.3倍，明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。表明轉(zhuǎn)P5CS基因植株在鹽和干旱脅迫下可大量合成脯氨酸，從而更能適應(yīng)逆境環(huán)境。

2.2.2丙二醛（MDA）含量

植物在逆境或衰老過程中遭受傷害時，因膜脂過氧化而導(dǎo)致生物膜的破壞，最終分解為MDA。MDA含量的高低與細胞膜的傷害程度呈正相關(guān)，即MDA含量可反映植物遭受逆境傷害的程度，含量越高表明對膜和細胞造成的傷害越大[10]。由圖3可知，在鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生MDA，但轉(zhuǎn)基因植株葉片MDA的產(chǎn)生量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。在150mmol/LNaCl脅迫和20%～25%的基質(zhì)含水量條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的MDA含量只有非轉(zhuǎn)基因植株的50.3%和65.8%，表明在鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株積累的MDA含量較少，使細胞膜傷害程度明顯降低而達到植株能夠較正常生長。

2.2.3超氧化物歧化酶（SOD）活性

SOD是清除植物體內(nèi)活性氧自由基的最重要的保護酶之一，在植物器官衰老或在逆境脅迫下，SOD能夠使細胞免受傷害從而起到保護作用，其活性越高清除活性氧的能力就越強。由圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和干旱脅迫下均具SOD活性，但轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。在150mmol/LNaCl脅迫和基質(zhì)含水量為20%～25%的干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性是非轉(zhuǎn)基因植株的2.67倍和2.87倍。表明轉(zhuǎn)P5CS基因植株在鹽和干旱脅迫條件下能夠增強SOD活性，進而減輕植株受脅迫的程度。

2.2.4鹽和干旱脅迫下植株生長勢的初步觀察

用150mmol/LNaCl和含水量為20%～25%的基質(zhì)對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株脅迫處理20d后的植株形態(tài)學(xué)觀察表明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽和抗干旱能力顯著提高。從圖5可以看出，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的下部葉片生長較正常，上部葉除葉尖發(fā)黃外其他葉片的長勢良好；而非轉(zhuǎn)基因植株中、下部葉片已干枯、死亡，上部葉片也明顯卷曲、干枯，葉片趨于死亡。在

鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株生長較良好，只有部分葉呈現(xiàn)少量的白色斑點或葉尖發(fā)黃、葉片發(fā)生微微卷曲、植株節(jié)間縮短的現(xiàn)象；而非轉(zhuǎn)基因植株葉片則全部萎蔫、卷曲嚴重，甚至干枯死亡。表明轉(zhuǎn)P5CS基因的“東農(nóng)303”馬鈴薯植株在鹽和干旱脅迫下生長勢明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因植株。

3結(jié)論與討論

與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)擬南芥P5CS基因的馬鈴薯品種“東農(nóng)303”在鹽和干旱脅迫下葉片中脯氨酸含量顯著增加，SOD活性明顯上升，而丙二醛積累量則緩慢，說明轉(zhuǎn)P5CS基因“東農(nóng)303”具有一定的耐鹽性和抗旱性。鹽和干旱等滲透脅迫會打亂植物細胞的水分平衡，造成植物細胞缺水，最直接的表現(xiàn)就是葉片的萎蔫程度。Sherraf等研究表明，在50mmol/LNaCl脅迫下，馬鈴薯植株生長勢是非脅迫下的50%；在150mmol/LNaCl脅迫下，馬鈴薯植株的生長勢會完全受到抑制，根部吸收能力受到阻礙，細胞間隙之間由堿性物質(zhì)所飽和，最終造成細胞壞疽和細胞死亡[11]，該研究結(jié)果與本試驗在150mmol/LNaCl脅迫下非轉(zhuǎn)基因植株葉片已干枯死亡的結(jié)果相一致。很多研究已證明轉(zhuǎn)入抗旱或耐鹽相關(guān)基因可提高農(nóng)作物對滲透脅迫的耐受能力，進而培育出高抗逆性的新品種。脯氨酸作為植物抵抗?jié)B透脅迫的重要滲透物質(zhì)，其積累是植物對逆境脅迫所采取的一種自我保護性措施，其含量可反映細胞抗逆性和受害程度[12-13]。Hmida-Sayari等將擬南芥的P5CS基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，獲得了4個轉(zhuǎn)基因株系，在100mmol/LNaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸積累量在180～1100μg/g鮮葉質(zhì)量，表明在相同的脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系間脯氨酸的合成量具有較大差異[14]。本研究中的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株在150mmol/LNaCl脅迫下脯氨酸積累量約為3000μg/g鮮葉質(zhì)量，較高，認為轉(zhuǎn)P5CS植株中脯氨酸的積累量可能是受品種、NaCl脅迫濃度、脅迫處理時間、目的基因拷貝數(shù)等的影響，具體的原因有待于進一步研究。

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