顧青青， 安 叡， 張藝竹， 于 靜， 劉自華， 王新宏

（上海中醫(yī)藥大學，上海201203）

不同產(chǎn)地海螵蛸中核苷類成分測定

顧青青， 安 叡*， 張藝竹， 于 靜， 劉自華， 王新宏

（上海中醫(yī)藥大學，上海201203）

目的比較研究不同產(chǎn)地海螵蛸的指紋圖譜，并測定其中核苷類成分的含有量。方法海螵蛸NaCl水溶液采用高效液相色譜法，色譜柱為資生堂PAK-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液，等度洗脫，檢測波長254 nm，柱溫25℃。用相似度評價系統(tǒng)軟件計算得到各批藥材的相似度。結(jié)果海螵蛸中的尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤分離度良好，線性范圍分別為1.25～12.50μg/mL、1.28～12.80μg/mL和5.05～50.50 μg/mL。25批樣品 （來自浙江、遼寧、云南、山東、廣西、福建）相似度均大于0.9；廣東的樣品相似度在0.97～0.78，差異較大；海南的樣品相似度均為0.88左右。結(jié)論本研究建立的HPLC指紋圖譜方法可有效地區(qū)分海螵蛸及其他貝殼類海洋藥材。

海螵蛸；HPLC；尿嘧啶；次黃嘌呤；黃嘌呤

海螵蛸為常用中藥，具有收斂止血、澀精止帶、制酸止痛、收濕斂瘡等作用?！吨袊幍洹肥蛰d的海螵蛸為烏賊科動物無針烏賊Sepiella maindroni de Rochebrune或金烏賊Sepia esculenta Hoyle的干燥內(nèi)殼［1］，近年來在中醫(yī)臨床及中成藥生產(chǎn)上得到越來越廣泛地應用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分為碳酸鈣、殼角質(zhì)和黏液質(zhì)等，可治療骨骼損傷［2］、 消化道潰瘍［3］、 婦科疾?。?］、 出血性疾病［5］、 肝纖維化［6］和眼部疾?。?］等。

核苷類化合物作為維持生命活動的基本組成元素，主要參與DNA代謝過程，具有抗癌、抗病毒等藥理活性［8］，在多種動物藥里大量存在。其中，腺苷、蟲草素等已成為冬蟲夏草的指標成分［9-10］。近年來，在海洋動物藥，如海綿［11］、柄海鞘［12］和?？?3］中也發(fā)現(xiàn)了該類化合物。另外，作為海洋藥用生物，海螵蛸還具有部分游離核苷類成分，如尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤等。本實驗采用HPLC法建立海螵蛸藥材的指紋圖譜，對所收集的30個海螵蛸樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤同時進行定量測定，發(fā)現(xiàn)該指紋圖譜穩(wěn)定，重復性好，可用于該藥材的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260型液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器、工作站 （美國安捷倫公司）；AL104電子天平 （110～0.00001 g，瑞士梅特勒公司）；DL-120D智能超聲波清洗器 （上海之信儀器有限公司）。

1.2 對照品與試劑 尿嘧啶 （上海源葉生物科技有限公司，批號TM0313XB13）；次黃嘌呤、黃嘌呤對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號分別為140661-200903、140662-200802）；氯化鈉、磷酸二氫鉀 （國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為10019318、10017608）；甲醇為色譜純 （美國Thermo Fisher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 實驗藥材 海螵蛸藥材30批，分別購自上海、浙江、江蘇、北京、安徽、河北等地，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學吳立宏研究員鑒定，均符合 《中國藥典》2010年版海螵蛸項下規(guī)定，見表1。

表1 海螵蛸樣品收集信息Tab.1 Origin for 30 batches of cuttlebone samples

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取海螵蛸藥材5.0 g粉碎，精密稱定，置于200 mL錐形瓶中，精密加入0.9%NaCl水溶液100 mL，密塞，室溫靜置12 h，離心15 min（3 000 r/min），放至室溫，用0.9% NaCl水溶液補足失質(zhì)量，并將其濃縮至10 mL，搖勻，取續(xù)濾液，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 對照品母液的配置 精密稱取對照品尿嘧啶1.25 mg、次黃嘌呤1.28 mg、黃嘌呤1.01 mg，分別置于10mL量瓶中，甲醇溶解，超聲后再用甲醇定容至刻度，即得對照品溶液。

2.2.2 混合對照品溶液的配置 精密移取尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤對照品母液 （分別為1、1、5mL）于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配置成混合對照品貯備液。其中含有尿嘧啶12.50 μg/mL、次黃嘌呤12.80μg/ML、黃嘌呤50.50 μg/mL。

2.3 色譜條件 資生堂PAK-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液；檢測波長254 nm；體積流量0.65 mL/min；柱溫25℃；進樣量20μL，記錄45 min色譜。在此條件下，對照品及樣品的色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按尿嘧啶峰、次黃嘌呤峰、黃嘌呤計算均不低于8 000。

圖1 對照品（A）與樣品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and saMp le（B）

2.4 海螵蛸中尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤的測定

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2.2”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、16、20μL進樣，按 “2.3”項色譜條件測定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，相應質(zhì)量濃度 （X，μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸分析，得尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤回歸方程分別為Y=121.8X-9.291（r= 0.999 5）、Y=126X+4.981（r=0.999 5）和Y= 3.704X-1.148（r=0.999 8），線性范圍分別為1.25～12.50μg/mL、1.28～12.80μg/mL和5.01～50.10μg/ML。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取 “2.2.2”項下混合對照品溶液，在 “2.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤的RSD（n=6）分別為0.5%、0.3%和0.4%，表明儀器精密度好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取15號海螵蛸藥材，按 “2.1”項下方法制備供試品溶液平行6份，連續(xù)進樣，測定峰面積。結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤含有量的平均值分別為1.07、1.43和19.73 mg/g，RSD分別為1.8%、1.4%和1.2%，表明重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取15號海螵蛸藥材，按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、6、15、24、36 h進樣，測定峰面積。結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤峰面積的RSD（n=6）分別為1.2%、0.8%和1.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定含有量的15號樣品 （尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤含有量分別為1.07%、1.43%和19.73%）粉末2.5 g，共6份，按各組分在樣品中的量，分別加入一定量混合對照品，按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣分析，計算平均回收率。結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤的平均回收率（n=6）分別為101.9%（RSD=2.2%）、102.3%（RSD=1.9%）和102.3%（RSD=1.8%）。

2.5 樣品測定 取30批不同產(chǎn)地的海螵蛸樣品，按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3”項條件進樣分析，以外標兩點法計算，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地海螵蛸中尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 DeterMination of uracil，hypoxanthine，and xanthine in cuttlebone froMdifferent regions（mg/g，n=3）

3 海螵蛸指紋圖譜的建立

3.1 精密度試驗 取同一份海螵蛸藥材的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖并積分，圖譜導入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版”處理，得到各次進樣的相似度。結(jié)果表明，6次進樣所得指紋圖譜的相似度高于0.99，符合指紋圖譜測定要求，精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份海螵蛸藥材供試品溶液，按 “2.1”項制備方法處理，分別在0、2、6、15、24、36 h進樣，記錄色譜圖并積分，計算36 h內(nèi)進樣所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，該指紋圖譜的相似度均高于0.99，符合指紋圖譜測定要求，穩(wěn)定性良好。

3.3 重復性試驗 取同一批海螵蛸藥材6份，按“2.1”項制備方法處理，分別進樣，記錄色譜圖并積分，計算6份海螵蛸藥材所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，6份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.99，符合指紋圖譜測定要求，重復性良好。3.4 指紋圖譜的相似度分析 分別取不同產(chǎn)地的30批海螵蛸樣品，按 “2.1”項下方法制備海螵蛸供試品，按 “2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，分別記錄色譜圖，導入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價2004 A版”評價軟件對其進行數(shù)據(jù)分析處理，以中位數(shù)法建立對照指紋圖譜，30批海螵蛸的指紋圖譜及相似度結(jié)果分別見圖2和表3。結(jié)果顯示，所測的不同產(chǎn)地海螵蛸的相似度范圍較寬。海螵蛸樣品中有25批樣品 （來自浙江、遼寧、云南、山東、廣西、福建）相似度均大于0.9；其中產(chǎn)地為廣東的樣品相似度在0.97～0.78，差異較大；產(chǎn)地為海南的樣品相似度均為0.88左右。

表3 30批不同產(chǎn)地海螵蛸樣品的相似度評價Tab.3 SiMilarity evaluation of 30 batches of cuttlebone

圖2 30批不同產(chǎn)地海螵蛸樣品的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜Fig.2 Thirty batches of cuttlebone of HPLC fingerprints froMdifferent regions and controlled fingerprint

3.5 系統(tǒng)聚類分析 從圖2可以看出，匹配后共有8個共有峰，其中4、5、6號峰分別為尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤的色譜峰。

以尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤的峰面積為指標，運用SPSS 18.0軟件對30批不同產(chǎn)地海螵蛸樣品進行聚類分析，采用組間均聯(lián)法（betweengroups linkage），以余弦為測度進行聚類，結(jié)果見圖3。由圖可知，海螵蛸的聚類具有一定的地域歸屬性，同一產(chǎn)地的海螵蛸親緣關(guān)系較近。例如，產(chǎn)地為浙江、遼寧、云南、廣西、福建的海螵蛸樣品親緣關(guān)系較近，這與相似度分析的判斷基本一致，其優(yōu)勢在于可以更直觀用于區(qū)分不同產(chǎn)地的海螵蛸。

4 討論

本實驗所建立的HPLC指紋圖譜測定方法可以使海螵蛸藥材0.9%生理鹽水提取液中的大部分小分子成分得到較好的分離，并且經(jīng)方法學考察，此法有較好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，能有效評價海螵蛸藥材的質(zhì)量。

尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤這類化合物均為偏堿性的水溶性成分，極性均較大，因此本實驗初步選擇以水相為流動相進行色譜分離，另外還對海螵蛸藥材的提取方法 （提取試劑及時間）、流動相系統(tǒng)和檢測波長進行了考察。結(jié)果表明，在提取試劑上，0.9%生理鹽水提取液的色譜峰較多，而20%及10%甲醇提取液的色譜峰較少；在提取時間上，設(shè)定了6、8、10、12、16 h的靜置時間，而且以0.9%NaCl水溶液為溶劑，制備靜置了12 h的供試液的色譜圖中信息量最豐富；在檢測波長上，通過二極管陣列檢測器在190～400 nm的紫外區(qū)進行在線檢測，發(fā)現(xiàn)所測成分在254 nm條件下的吸收最強，所提供的信息量最豐富，各峰的比例最適合，故選擇254 nm作為檢測波長。

圖3 不同產(chǎn)地海螵蛸聚類分析Fig.3 Clustering analysis of cuttlebone froMdifferent regions

由于海螵蛸藥材有效成分尚不明確，所以其質(zhì)量標準一直停留在定性鑒別上，而沒有定量指標。本實驗通過指紋圖譜來測定海螵蛸中核苷類成分的含有量，可對其進行成分半定量的控制，從而為提高海螵蛸的質(zhì)量標準提供了可能。

本實驗對30批次不同產(chǎn)地海螵蛸的指紋圖譜進行相似度比較，它們分別購自各地藥材市場及藥店。結(jié)果表明，除來自廣東及海南的樣品相似度較低之外，其余樣品相似度均大于0.9，且與核苷類成分含有量具有一定的相關(guān)性，說明所建立的指紋圖譜可較好地用于評價海螵蛸的質(zhì)量。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，當樣品中尿嘧啶與次黃嘌呤量的比例在1.30±0.17范圍內(nèi)時，其相似度為0.99～0.97；當樣品中尿嘧啶與次黃嘌呤量的比例在0.62±0.09范圍內(nèi)時，其相似度為0.97～0.90。以上結(jié)果顯示，所建立的指紋圖譜可較好地區(qū)分不同產(chǎn)地的海螵蛸，可用于其質(zhì)量控制。

另外，本實驗建立的HPLC指紋圖譜方法具有特征性，考察了牡蠣、石決明、蛤殼和珍珠母這些貝殼類海洋藥物，在確定的HPLC指紋圖譜條件下測定。結(jié)果顯示 （如圖4），該方法可有效地區(qū)分海螵蛸及其他貝殼類海洋藥物。

圖4 海螵蛸與其他貝類的指紋圖譜Fig.4 Fingerprints of cuttlebone and other shellfish

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DeterMination of nucleotides of cuttlebone froMdifferent regions

GU Qing-qing， AN Rui*， ZHANG Yi-zhu， YU Jing， LIU Zi-hua， WANG Xin-hong
（ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

AIMTo compare the HPLC fingerprints of cuttlebone（Sepiae endoconcha）froMdifferent regions and determine the nucleotides content.METHODSHPLC analysisof NaCl solution of cuttlebonewas carried outon Shiseido PAK-C18（4.6mm×250 mm，5μm）with amobile phase of0.01mol/L potassiuMdihydrogen phosphate solution in an isocraic elutionmanner，the flow rate was 0.65 mL/min，the sample amountwas 20μL，the detection wavelength was set at 254 nMand the column temperature wasmaintained at 25℃.The similarity software was used to evaluate the fingerprint similarity among the batches.RESULTSThemethod had good linear relationship within the range 1.25-12.50μg/mL for uracil，1.28-12.80μg/mL for hypoxanthineand，and 5.05-50.50μg/mL for xanthine.The similarity of twenty-five batcheswas greater than 0.9 collected froMZhejiang，Liaoning，Yunnan，F(xiàn)ujian Province，and Guangxi region，the similarity of samples froMGuangdong Provincewas over a wide range of 0.97-0.78，and the similarity of samples froMHainan Province was in 0.88 range.CONCLUTIONThe established fingerprintmethod can effectively distinguish cuttlebones froMothermarine shells.

cuttlebone（Sepiaeendoconcha）；HPLC；uracil；hypoxanthine；xanthine

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1016-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.020

2014-07-21

國家 “863”計劃—海洋生物來源中藥材質(zhì)量標準研究 （2013AA093002）

顧青青 （1989—），女，碩士，研究方向為藥物分析與體內(nèi)過程。Tel：（021）51322450，E-mail：gqq19890428qq@126.com

*通信作者：安 叡 （1973—），女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥質(zhì)量標準研究。Tel：（021）51322183，E-mail：anruimw@126.com