陸庭嫣，沈俐，唐振華

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院，上海200030)

不同培養(yǎng)基及B族鏈球菌增菌肉湯檢測(cè)B族鏈球菌效果評(píng)價(jià)

陸庭嫣，沈俐，唐振華

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院，上海200030)

目的通過(guò)分析B族鏈球菌(GBS)檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率和平板選擇性能來(lái)評(píng)價(jià)GBS篩查培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和GBS增菌肉湯檢測(cè)結(jié)果的可靠性和臨床應(yīng)用的可行性。方法收集妊娠晚期35～37周孕婦陰道下端及肛周樣本242例、中段尿樣本15例，同時(shí)直接接種及經(jīng)GBS增菌肉湯增菌后接種哥倫比亞血平板和GBS篩查平板，觀察各培養(yǎng)基上GBS的生長(zhǎng)情況。結(jié)果直接接種后分別培養(yǎng)24 h和48 h，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基GBS的檢出率均為7.39%(19/257);而GBS篩查培養(yǎng)基的檢出率為24 h 5.45%(14/257)、48 h 7.39% (19/257)。經(jīng)GBS增菌肉湯增菌后，無(wú)論培養(yǎng)時(shí)間是24 h還是48 h，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基GBS的檢出率均為9.73%(25/257);GBS篩查培養(yǎng)基的檢出率均為8.95%(23/257)。與直接接種相比，選擇性增菌后GBS的檢出率明顯升高;2種培養(yǎng)基GBS的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論臨床樣本先經(jīng)GBS增菌肉湯18～24 h增菌后再接種至GBS篩查培養(yǎng)基或哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，24 h即可觀察生長(zhǎng)結(jié)果，GBS菌落易于辨認(rèn)且提高了陽(yáng)性檢出率。

B族鏈球菌;B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基;哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基;B族鏈球菌增菌肉湯;陽(yáng)性檢出率

B群鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)又稱無(wú)乳鏈球菌(Steptococcus agalactiae)，是一種條件致病菌，是新生兒和孕婦圍產(chǎn)期感染的重要病原菌，可造成孕婦菌血癥、無(wú)癥狀菌尿癥、羊膜炎和傷口感染等，造成新生兒敗血癥、肺炎和腦膜炎等［1-3］。新生兒早發(fā)型GBS感染主要與母體垂直傳播有關(guān)，母親孕期泌尿生殖道或胃腸道的GBS定植是新生兒早發(fā)型GBS感染的主要危險(xiǎn)因素［4-6］。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室有必要加強(qiáng)對(duì)晚期妊娠孕婦的GBS篩查。研究顯示［7］歐洲孕期婦女陰道及直腸GBS的定植率為6.5%～36.0%，在非洲坦桑尼亞婦女陰道及直腸GBS的定植率為23%。我國(guó)文獻(xiàn)報(bào)道［5，8-9］母體GBS帶菌率為3.4%～15.8%，定植率的不同可能與國(guó)家地區(qū)、種族基因、年齡、教育程度、培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)頻率不同有關(guān)。我們比較了GBS增菌肉湯增菌前、后哥倫比亞血平板和GBS篩查平板的GBS檢出率。

材料和方法

一、菌株

1.臨床菌株盲選收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院2013年4月至7月的妊娠晚期(35～37周)孕婦陰道下端及肛周樣本242例、中段尿樣本15例。

2.質(zhì)控菌株無(wú)乳鏈球菌ATCC 12386、大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、白念珠菌ATCC 10231。

二、儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱VITEK 2 Compact)及其配套革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司)，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、GBS增菌肉湯、GBS篩查培養(yǎng)基購(gòu)自梅里埃(上海)生物制品有限公司。革蘭染色試劑和觸酶試劑購(gòu)自珠海貝索公司。

三、方法

1.采樣35～37周妊娠晚期孕婦陰道下端及肛周樣本無(wú)菌棉簽采集后洗脫在1.5 mL無(wú)菌生理鹽水中。

2.直接接種分別吸取50 μL樣品，直接涂布在GBS篩查培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，35℃、5%CO2條件下孵育。

3.增菌后接種吸取50 μL樣品，于GBS增菌肉湯中增菌，35℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18～24 h后用無(wú)菌棉簽涂布于GBS篩查培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基倒置，于35℃、5%CO2條件下進(jìn)行孵育。

四、結(jié)果判讀和鑒定

1.GBS篩查培養(yǎng)基在35℃、5%CO2條件下避光孵育18～24 h，若觀察到粉色至紅色典型菌落，挑取典型菌落采用VITEK 2 Compact進(jìn)一步鑒定確認(rèn)，記錄結(jié)果;若沒(méi)有觀察到典型菌落將孵育時(shí)間延長(zhǎng)到48 h，挑取典型菌落采用VITEK 2 Compact進(jìn)一步鑒定并記錄結(jié)果。

2.哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基在35℃、5% CO2條件下孵育18～24 h，對(duì)可疑的菌落(中小灰白，有β溶血)用革蘭染色和觸酶試驗(yàn)篩選，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌和觸酶陰性的可疑菌落用VITEK 2 Compact進(jìn)一步確認(rèn)，若沒(méi)有觀察到可疑菌落將孵育時(shí)間延長(zhǎng)到48 h。

3.GBS篩查培養(yǎng)基的選擇性能對(duì)接種到GBS篩查培養(yǎng)基上的非目標(biāo)菌群生長(zhǎng)密度進(jìn)行了記錄(培養(yǎng)時(shí)間相同)，記錄方法如下:以生長(zhǎng)密度計(jì)，0為無(wú)生長(zhǎng)、1為一區(qū)生長(zhǎng)(或1～9個(gè)菌落)、2為二區(qū)生長(zhǎng)(或10～99個(gè)菌落)、3為三區(qū)生長(zhǎng)(或100～999個(gè)菌落)、4為四區(qū)生長(zhǎng)(或1 000個(gè)以上的菌落)。

五、質(zhì)控

所有培養(yǎng)基均采用相應(yīng)菌株做質(zhì)控，見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基質(zhì)控表

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Stata 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩種培養(yǎng)基的陽(yáng)性檢出率比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、2種培養(yǎng)基直接接種的陽(yáng)性檢出率比較

直接接種后哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24和48 h的GBS檢出率均為7.39%(19/257);GBS篩查培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的GBS檢出率為5.45% (14/257)，培養(yǎng)48 h為7.39(19/257)。2種培養(yǎng)基的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2種培養(yǎng)基直接接種的檢測(cè)結(jié)果

二、增菌后接種2種培養(yǎng)基陽(yáng)性檢出率的差異經(jīng)GBS增菌肉湯增菌后，無(wú)論培養(yǎng)24 h還是48 h，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基GBS的檢出率為9.73%(25/257);GBS篩查培養(yǎng)基的檢出率為8.95%(23/257)。2種培養(yǎng)基的陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。與直接接種比較，增菌后再培養(yǎng)的GBS檢出率明顯提高。

表3 經(jīng)GBS增菌肉湯增菌后2種培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

三、GBS篩查培養(yǎng)基選擇性能

在GBS篩查培養(yǎng)基上非目標(biāo)菌群(大多為腸球菌、酵母樣真菌、其他鏈球菌)集中表現(xiàn)為藍(lán)色、藍(lán)-灰、藍(lán)-紫和淡綠色等菌落。這些菌落在培養(yǎng)24 h時(shí)大多被抑制或生長(zhǎng)細(xì)小，培養(yǎng)48 h會(huì)有部分生長(zhǎng)，但與目標(biāo)菌GBS的中等大小淺紅至紅的典型菌落區(qū)分明顯。有部分非典型小紅色菌落鑒定為草綠色鏈球菌(樣本編號(hào)為80、85、217、231、779、915)或糞腸球菌(樣本編號(hào)493)。見(jiàn)表4。

表4 GBS篩查培養(yǎng)基的選擇性能

討論

GBS的檢測(cè)方法多樣，最常見(jiàn)的培養(yǎng)法、抗原檢測(cè)法及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法各有優(yōu)缺點(diǎn)。培養(yǎng)法直觀、準(zhǔn)確，但培養(yǎng)周期長(zhǎng);抗原檢測(cè)法快速，但假陰性不易排除;PCR法快速、敏感，但假陽(yáng)性不易排除。對(duì)于危急患者建議選擇PCR法，但對(duì)于一般的孕婦妊娠晚期篩查還是培養(yǎng)法較為經(jīng)典，可以在特定的階段用藥預(yù)防感染［8，10-11］。

本研究結(jié)果顯示直接接種哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24和48 h的GBS檢出率均為7.39%，這與我院歷年孕前GBS篩查5%～7%的陽(yáng)性率基本相符;GBS篩查培養(yǎng)基檢出率培養(yǎng)24 h為5.45%、培養(yǎng)48 h為7.39%，提示臨床樣本直接接種GBS篩查培養(yǎng)基時(shí)不能只觀察24 h的結(jié)果，須延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至48 h才能減少漏檢的可能。通過(guò)GBS增菌肉湯增菌18～24 h后，無(wú)論培養(yǎng)24 h還是48 h，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基GBS檢出率均為9.73%，GBS篩查培養(yǎng)基檢出率均為8.95%。與直接接種比較，增菌后再培養(yǎng)的GBS檢出率明顯提高。增菌后的GBS生長(zhǎng)觀察時(shí)間可以縮短至24 h。分析GBS篩查培養(yǎng)基GBS檢出率略低于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基的原因可能是選擇性篩查培養(yǎng)基因含有混合抗生素，可抑制雜菌的生長(zhǎng)，但也可能會(huì)同時(shí)輕度抑制GBS的生長(zhǎng)或影響培養(yǎng)基最低檢出量的敏感性。當(dāng)然，這還需要更大樣本量的檢測(cè)分析及培養(yǎng)基靈敏度實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

從培養(yǎng)基的選擇性能來(lái)看，因陰道或肛周菌群較多，所以樣本直接接種哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基時(shí)GBS生長(zhǎng)受其它細(xì)菌影響較大，辨認(rèn)時(shí)需要工作人員有一定的經(jīng)驗(yàn)，但經(jīng)GBS增菌肉湯增菌后培養(yǎng)基上的非目標(biāo)菌受抑制，GBS增量且易于辨認(rèn)。GBS篩查培養(yǎng)基上的GBS目標(biāo)菌為中等大小淺粉至紅色的菌落，大多數(shù)的非目標(biāo)菌群得到很好的抑制，表現(xiàn)為藍(lán)色、藍(lán)-灰、藍(lán)-紫和淡綠色等菌落，易于辨認(rèn)。

本研究中不容忽視的是GBS增菌肉湯的作用。增菌肉湯含有抗菌藥物(萘啶酸和黏菌素)能抑制樣本中大部分革蘭陰性菌的生長(zhǎng)，并且其中有助于鏈球菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分彌補(bǔ)了GBS可能被輕度抑制的缺陷。與直接接種比較，增菌后再培養(yǎng)的GBS檢出率明顯提高。甚至可將GBS增菌肉湯增菌這一步的檢驗(yàn)步驟提前，將其作為GBS單項(xiàng)檢測(cè)的一種運(yùn)送培養(yǎng)基，臨床醫(yī)生取完樣本后直接就可以置入增菌肉湯中等待送檢，這樣也避免了常規(guī)樣本取材后因不能立即送檢，導(dǎo)致拭子干燥，致使GBS出現(xiàn)部分死亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示對(duì)孕婦晚期妊娠的GBS篩查培養(yǎng)的理想模式為臨床樣本先經(jīng)GBS增菌肉湯18～24 h增菌后再接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基或GBS篩查培養(yǎng)基，24 h即可觀察培養(yǎng)結(jié)果。GBS增菌肉湯減小了接種哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基時(shí)雜菌對(duì)GBS生長(zhǎng)的影響，也彌補(bǔ)了單純接種GBS篩查培養(yǎng)基敏感性較低，易導(dǎo)致漏檢的缺點(diǎn)，從而發(fā)揮出GBS篩查培養(yǎng)基目標(biāo)菌識(shí)別快速、簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，保證了GBS陽(yáng)性檢出率的提高。

［1］American Academy of Pediatrics Comm ittee on Infectious Diseases and Committee on Fetus and Newborn.Revised guidelines for prevention of earlyonset group B streptococcal(GBS)infection［J］.Pediatrics，1997，99(3):489-496.

［2］BOYER KM，GADZALA CA，KELLY PD，et al.Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease.Ⅱ.Predictive value of prenatal cultures［J］.J Infect Dis，1983，148(5):802-809.

［3］張娟，康喆，郭金珍，等.新生兒早發(fā)型B族溶血性鏈球菌敗血癥并發(fā)化膿性腦膜炎大面積腦梗死一例［J］.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，17(6):430-431.

［4］沈定樹(shù)，周雪艷.無(wú)乳鏈球菌的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2008，20(5):518-519.

［5］季修慶，陸根生，胡平，等.熒光定量PCR檢測(cè)南京地區(qū)孕晚期婦女生殖道B族鏈球菌的帶菌情況［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，29(6):628-630.

［6］陳慧慧，范建霞，陸庭嫣，等.孕婦B族溶血性鏈球菌感染對(duì)母嬰的影響［J］.上海醫(yī)學(xué)，2009，32(2): 128-130.

［7］BARCAITE E，BARTUSEVICIUS A，TAMELIENE R，et al.Prevalence of maternal group B streptococcal colonisation in European countries［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2008，87(3):260-271.

［8］時(shí)春艷，曲首輝，楊磊，等.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測(cè)及帶菌對(duì)妊娠結(jié)局的影響［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45(1):12-16.

［9］應(yīng)群華，嚴(yán)文衛(wèi)，丁金龍.圍產(chǎn)期生殖道菌群檢測(cè)和B群鏈球菌篩查［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18(6):491-492.

［10］陳學(xué)兵，王沛.孕婦生殖道B群鏈球菌快速診斷方法探討［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(3): 443-444.

［11］何國(guó)才，白清，李高.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌感染的研究狀況［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(14):2255-2257.

Evaluation on the efficiency of different med ia and GBS enrichment broth for GBS detection

LU Tingyan，SHEN Li，TANG Zhenhua.(The International Peace Maternity and Child Health Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200030，China)

ObjectiveTo evaluate the reliability of Group B Streptococcus(GBS)screening medium，Colombia blood agar medium and GBS enrichment broth detection results and investigate the viability of clinical application by analyzing the positive rate of GBS and the performance of selective plates.MethodsA total of 242 samples from distal vaginal segment and around crissum and 15 m idstream urine samples were collected among 35-37-week pregnant women.The samples were inoculated directly and with one more step of GBS enrichment broth on Colombia blood agar and GBS screening media，respectively，and the growth of GBS in the 2 kinds of media was observed.ResultsAs for inoculating directly，the detection rates of GBS in Colombia blood agar medium for 24 h and 48 h were 7.39%(19/257)，and the 24 h and 48 h detection rates of GBS in GBS screening medium were 5.45%(14/257)and 7.39%(19/257)，respectively.As for inoculating with one more step of GBS enrichment broth，for neither 24 h nor 48 h，the detection rate of GBS in Colombia blood agar medium was 9.73%(25/257)，and the detection rate in GBS screening medium was 8.95%(23/257)，both of which had an evident increasing comparing with the former one.There was no statistical significance for the detection rate between the 2 kinds of media(P＞0.05).ConclusionsBy enriching 18 h-24 h in GBS enrichment broth，followed by inoculating in GBS screening medium or Colombia blood agar medium，the growth of GBS from clinical samples in media could be observed just after 24 h，and this method has simple recognition ability for GBS and can improve GBS positive detection rate.

Group B Streptococcus;Group B Streptococcus screening medium;Colombia blood agar medium; Group B Streptococcus enrichment broth;Positive detection rate

1673-8640(2015)09-0890-04

R378.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.006

2014-12-19)

(本文編輯:龔曉霖)

陸庭嫣，女，1973年生，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)工作。

唐振華，聯(lián)系電話:021-64070434-28801。