林波，文隨方，云沖,*，向世英,*

(1 海南醫(yī)學院 海南省腫瘤發(fā)生和干預重點實驗室, 海口 571199；2 海南通用三洋藥業(yè)有限公司, 海口 570312)

替卡西林鈉/克拉維酸鉀(15:1)是β-內(nèi)酰胺類抗生素，控制該類抗生素的高分子雜質的含量，是減少過敏反應的關鍵[1]。克拉維酸鉀是β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可保護替卡西林鈉不受β-內(nèi)酰胺酶的破壞。中國藥典2010年版二部注射用替卡西林鈉/克拉維酸鉀標準中未檢查高分子雜質，目前國內(nèi)主要采用Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)測定β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質[2]，但在該系統(tǒng)下，克拉維酸鉀的出峰位置與高分子雜質相同，因此不能用它測定這種藥品。

文獻報道的這種藥物的檢測方法是利用TSK-GEL G2500PWxl凝膠系統(tǒng)分離，但報道的方法由于選取的磷酸鹽濃度不合適，不能把替卡西林鈉克拉維酸鉀分離，不能得到較好的檢測結果[3]。本試驗通過考察不同濃度的磷酸鹽對測定替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中高分子雜質分離效果的影響，找出較好的磷酸鹽緩沖液作為流動相，使替卡西林、克拉維酸及高分子雜質的峰達到很好的分離。并通過方法學驗證。

1 試驗條件及方法

1.1 儀器與試驗藥物

戴安高效液相色譜儀(型號：Thermo/Ultimate3000)，變色龍7色譜工作軟件。

注射用替卡西林鈉/克拉維酸鉀(15:1) 樣品，由海南通用三洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為131001、131003及131006；對照品替卡西林(批號130569-200902，含量84.0% )購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測波長及溶媒的選擇

通過紫外掃描，本品中高分子雜質及主成分均在230 nm處有較大的吸收，故采用230 nm為檢測波長。以水為溶媒時，溶劑峰干擾樣品的測定，而選擇流動相作為溶媒時，對樣品測定無干擾。

1.2.2 色譜條件

采用TSK-GEL G2500PWxl(7.8 mm×30cm，粒徑7μm)色譜柱，檢測波長230 nm柱溫30℃。

1.2.3 測定法

取本品適量，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中含替卡西林鈉1.0mg的溶液，作為供試品溶液(臨用新配)；另取替卡西林對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含10μg的溶液，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，按外標法以峰面積計算保留時間小于替卡西林鈉的雜質總量。

2 試驗結果

2.1 流動相的選擇

以不同濃度的磷酸鹽緩沖液作為流動相：A.0.02mol/L磷酸氫二鈉-0.02mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；B. 0.03mol/L磷酸氫二鈉-0.03mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；C. 0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04mol/L磷酸二氫鈉(95:5)；D. 0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉(95:5)?？疾旄叻肿与s質峰與主峰的分離情況，結果見圖1和表1。

從圖1中看，在一定范圍內(nèi)，隨著磷酸鹽濃度的增大，主峰替卡西林出峰時間越晚。高分子雜質峰與主峰的距離越大，但隨著磷酸鹽濃度的增大，主峰拖尾越嚴重，當磷酸鹽濃度的增大到D濃度時[0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉(95:5)]，由于主峰拖尾嚴重已不能和克拉維酸很好分離。

從圖1看，C濃度[0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04mol/L磷酸二氫鈉(95:5)]的三個峰分離度較好。從表1數(shù)據(jù)中也看出C濃度的分離效果較好。因此利用它作為流動相，進行一下步的方法學驗證實驗。

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性試驗

分別采用A： 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，B：0.1mol/L鹽酸溶液，C：照度為(4500±500)LX強光，D：60℃高溫及下放置10 d，E：30%的雙氧水溶液強制破壞試驗考察本品高分子雜質與主峰的分離情況。結果供試品經(jīng)破壞后，高分子雜質均有增加，其中經(jīng)堿破壞及氧化破壞后高分子雜質增加尤為明顯。結果表明，高分子雜質峰與主峰有效分離，本色譜系統(tǒng)專屬性良好，分析結果見圖2。

2.2.2 儀器精密度試驗

取替卡西林對照品適量，流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含10μg的溶液，作對照品溶液。精密量取對照品溶液20μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，計算主峰面積的RSD為0.40%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.3 檢測限、定量限測定

圖1 替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質(在A、B、C、D 4種流動相體系下的分離)

取替卡西林對照品溶液，逐步稀釋，至色譜圖中主峰的峰高約為基線噪音的3倍(檢測限)及基線噪音的10倍(定量限)，計算得替卡西林的檢測限為50ng(S/N≈3)，定量限為300ng(S/N≈10)。

2.2.4 對照品線性試驗

稱取替卡西林對照品12.82mg，置于100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取1.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.5mL和10mL，分別置于50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為20%、60%、80%、100%、120%、150%和200%的對照品溶液。精密量取上述溶液各20μl注入液相色譜儀，將測得峰面積與進樣量作線性回歸。試驗結果表明：對照品溶液在2.154 μg/mL~21.538 μg/mL濃度范圍有良好的線性關系，線性方程與相關系數(shù)為：Y=0.4075X+0.0157；r=0.99998。

表1 不同磷酸鹽濃度流動相對測定結果的影響

2.2.5 供試品溶液濃度與高分子雜質相關性試驗

圖2 專屬性試驗HPLC圖

分別稱取樣品(批號：131001)適量，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約0.5mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.5mg和2.0mg替卡西林鈉的溶液，相當于高分子雜質測定供試品溶液濃度的50%、80%、100%、120%、150%和200%，精密量取上述溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，結果供試品溶液在0.504mg/mL~1.997mg/mL濃度范圍，有良好的線性關系，線性方程Y=3.3941X-0.0238；r=0.9995。

2.2.6 重復性試驗

稱取樣品(批號：131001)適量，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中含替卡西林鈉1.0mg的溶液，作供試品溶液(臨用新配)，平行配制六份，分別為：0.716mg、0.718mg、0.730mg、0.728mg、0.728mg、0.734mg精密稱取替卡西林對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中約含替卡西林10μg的溶液，作對照品溶液。精密量取上述供試品溶液和對照品溶液取各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法以峰面積計算保留時間小于替卡西林鈉的雜質總量。其平均值(%)為0.726；RSD(%)為0.50。試驗結果表明測定方法的重復性良好。

2.2.7 中間精密度試驗

取本品(批號：131001)，照重復性試驗項下的方法，由兩個試驗人員，在不同日期，使用兩臺高效液相色譜儀檢測，根據(jù)記錄的色譜圖，按外標法以峰面積計算保留時間小于替卡西林鈉高分子雜質總量。測定12份樣品的高分子雜質(%)分別為0.716、0.718、0.730、0.728、0.728、0.734、0.744、0.746、0.740、0.750、0.731、0.737，其平均值為0.734；試驗結果表明：RSD(%)=1.4%，小于5%，中間精密度結果良好，能滿足本品高分子雜質測定要求。

2.2.8 樣品的檢測

取本公司生產(chǎn)的3批注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)，批號為131001、131003、131006，采用TSK-GEL G2500PWxl凝膠色譜系統(tǒng)測定，結果見表2。

3 討論

3.1 流速及柱溫的選擇

為了考察色譜條件的耐用性，故作了以下不同流速及柱溫下的試驗，結果見表3。

結果表明，替卡西林鈉與高分子雜質的分離度均大于1.5，此色譜條件的耐用性結果良好。在保證主峰出峰時間，以及替卡西林鈉與高分子雜質分離度的前提下，選擇了0.8mL/min作為流速，柱溫為30℃。

表2 樣品測定

表3 不同流速及柱溫下替卡西林鈉與高分子雜質峰分離度

3.2 與文獻報道方法比較

文獻報道的這種藥物的檢測方法選取的磷酸鹽濃度為0.15mol/L磷酸氫二鈉：0.15mol/L磷酸二氫鈉(95:5)為流動相，不太合適，因為在這個濃度下，其替卡西林主峰由于拖尾嚴重而和克拉維酸峰混在一起，而且其高分子峰也變形為兩個峰，不能得到較好的檢測結果[3]。而我們的方法可以使高分子、替卡西林和克拉維酸三個峰分離度較好，而且三個峰的峰形也較好。

3.3 結論

采用0.04mol/L磷酸氫二鈉-0.04 mol/L磷酸二氫鈉(95:5)為流動相，測定替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質，替卡西林鈉與高分子雜質可以達到很好的分離。經(jīng)方法學驗證表明，本法專屬性、相關性、重現(xiàn)性良好，操作簡單、快速，測定結果準確，可用于替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質檢測。

[1] 胡昌勤. β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物分析技術展望[J]. 中國新藥雜志, 2008, 17(24):2098-2112.

[2] 夏鳴, 杭太俊, 李小敏, 等. β-內(nèi)酰胺抗生素高分子聚合物雜質檢查方法的研究綜述[J]. 藥學進展. 2007, 31(11):501-507.

[3] 鐘雅妮，劉俊華, 林小潔, 等. HPLC法測定替卡西林鈉克拉維酸鉀(15:1)中的高分子雜質[J]. 藥物分析雜志, 2011,31(5)：871-874.