趙永烈，王玉來，姚卓亭，岳廣欣

·基礎醫(yī)學論著/研究·

芎芷地龍湯對偏頭痛風熱證模型NO、NOS、cGMP的影響

趙永烈1，2，王玉來1，姚卓亭1，岳廣欣3

目的 探討芎芷地龍湯對偏頭痛風熱證一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)的影響。方法 使用熱風及硝酸甘油協(xié)同誘導建立大鼠偏頭痛風熱證模型，觀察2 h內搔頭次數(shù)，用放免法測定血漿中環(huán)鳥苷酸的含量，用硝酸還原酶法測定血漿中一氧化氮的含量，用比色法測定血漿中一氧化氮合酶的含量。結果 偏頭痛模型組血漿NOS、NO、cGMP含量升高，與正常組、風熱組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；偏頭痛風熱證組血漿NOS、NO、cGMP含量繼續(xù)升高，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)過治療后血漿NOS、NO、cGMP含量恢復，與偏頭痛風熱證組及偏頭痛模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 風熱對正常機體無影響，而對硝酸甘油致偏頭痛模型病理狀態(tài)有顯著影響，偏頭痛模型受風熱外襲后血漿NOS、NO、cGMP含量持續(xù)升高，芎芷地龍湯能明顯改善偏頭痛風熱證動物模型血漿中升高的NOS、NO、cGMP含量。

偏頭痛；風熱證；芎芷地龍湯；一氧化氮；一氧化氮合酶；環(huán)鳥苷酸

研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)是一個小的氣體信使物質，能控制神經(jīng)信息的傳遞和血管緊張度，調節(jié)基因轉錄和蛋白質生物合成，誘導蛋白質轉譯后修飾[1]。NO被普遍認為是引起原發(fā)性頭痛的觸發(fā)物[2]，在偏頭痛患者外周血中可檢測到NO水平升高[3]，NO釋放可擴張腦膜血管并激活神經(jīng)元[4，5]，進而增加痛覺的傳導，導致中樞敏化[6，7]。NO由一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase，NOS)產(chǎn)生，NO信號傳導激活可溶性鳥苷環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，進而引起蛋白激酶的磷酸化。而蛋白激酶是重要的細胞內信號傳導分子，是作為第二信使通路與c-fos(即早基因蛋白表達)偶聯(lián)，被廣泛應用作為神經(jīng)元和痛覺激活的標志，在調節(jié)疼痛中發(fā)揮著重要的作用[8]。我們前期實驗證實了芎芷地龍湯有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，并顯示與劑量有一定的關系，以中劑量的作用最為穩(wěn)定[9，10]。并研究了芎芷地龍湯對偏頭痛風熱證血管活性物質內皮素(ET)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、血栓素A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)的影響[11]，為進一步研究偏頭痛受風熱侵襲后，痛覺敏化行為及機制，本實驗以血漿中NO、NOS、cGMP為觀察指標，研究偏頭痛風熱證模型中NO、NOS、cGMP含量的變化規(guī)律及芎芷地龍湯對各項指標的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級雄性SD大鼠40只，體重150 g～180 g，由北京維通利華實驗動物研究所提供，合格證號：SCXK(京)2005-0005。適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為正常組、偏頭痛模型組、風熱組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組，每組8只。動物分籠群養(yǎng)，室內溫度21 ℃～27 ℃，相對濕度45%～55%。各組大鼠喂常規(guī)飼料，自由進食飲水。

1.2 藥品 芎芷地龍湯[組成：川芎15 g，白芷15 g，生石膏(后下)30 g，地龍20 g，元胡10 g]，飲片均購于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥房，自行按常規(guī)煎煮法煎煮并濃縮，每毫升含生藥1.8 g；氯化鈉注射液每袋500 mL，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號A200909154；硝酸甘油注射液5 mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20091025；NO測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20091020；NOS測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20091020；cGMP放免分析試劑盒，北京華英生物技術研究所生產(chǎn)，批號：20091021。

1.3 主要儀器 MDF-330低溫冰箱；GC-911γ放免計數(shù)器；GL20低溫高速離心機；721分光光度計；電吹風 PHILIPS HP8200。

1.4 模型制備與藥物干預 實驗第1日開始，風熱組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組每日早晨固定時間予電吹風吹熱風，1檔熱度，風力1級，距離約45 cm，溫度控制于39 ℃～41 ℃，連續(xù)吹風7 d，每次2 h，第8日灌胃后30 min，偏頭痛模型組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，復制實驗性偏頭痛動物模型，正常組、風熱組皮下注射等量的生理鹽水。實驗第5日開始灌胃給藥，連續(xù)4 d，中藥治療組灌胃給予芎芷地龍湯(10.8 g/kg)，其余組均灌胃等量生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況觀察 動物喂養(yǎng)7 d內的一般情況，包括活動情況、皮毛色澤、進食、大便性狀。觀察第8日皮下注射硝酸甘油或生理鹽水后各組大鼠行為改變，并計大鼠搔頭次數(shù)：以前肢搔臉一次計一次，后肢快速搔頭動作從開始到停止計一次，人工觀察計算每只大鼠皮下注射后至2 h的搔頭次數(shù)，以判斷實驗模型復制是否成功。

1.5.2 血漿標本處理制備 采集頸靜脈血6 mL，其中3 mL置入預冷的試管中，每毫升全血加抑肽酶20 μL、10%EDTA-Na215 μL，混勻，迅速低溫(4 ℃)離心10 min(3 000 r/min)，分離血漿，置-20 ℃保存待測，用于血中cGMP的測定；另3 mL，每毫升全血加EDTA-Na215 μL顛倒混勻，800 r/min離心10 min，分離血漿，置-4 ℃保存，用于血中NO、NOS的測定。

1.5.3 NO、NOS的測定 NO的測定采用硝酸還原酶法(測定步驟按照試劑盒說明書進行)；NOS的測定采用比色法(測定步驟按照試劑盒說明書進行)；cGMP的測定采用放免法(測定步驟按照試劑盒說明書進行)，由自動γ計數(shù)儀器直接讀出結果。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況觀察 各組大鼠在飼養(yǎng)期間均毛發(fā)光潔整齊，食欲可，行動靈活敏捷。風熱組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組在吹熱風時均有部分大鼠出現(xiàn)煩躁、籠內站立、跳躍，鼻出血的情況。實驗開始吹風處理前觀察各組大鼠大便，多為軟便、中等質地或偏硬質潤，開始吹風后，風熱組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組大鼠大便無軟便，少見中等質地，多為偏硬質潤或干硬便，而正常組與偏頭痛模型組以中等及偏硬質潤便為多。

各組大鼠耳廓與眼結膜的研究，偏頭痛模型組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組耳廓漫紅，結膜血管紋路明顯，而正常組與風熱組耳廓整體顏色較淡，結膜脈絡無其他3組明顯，體現(xiàn)了硝酸甘油對耳廓、結膜血管的擴血管作用。

2.2 芎芷地龍湯對偏頭痛風熱證實驗動物模型行為變化的影響 偏頭痛模型組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組皮下注射硝酸甘油后5 min出現(xiàn)煩躁，活動增多，前肢及后肢頻繁搔頭，雙耳耳廓血管較正常組增粗，且血管增長直抵耳緣，結膜血管紋路明顯，中藥治療組煩躁、搔頭的表現(xiàn)較偏頭痛模型組及偏頭痛風熱證組少，3組在1 h時基本安靜蜷臥，其后間斷活動，以蜷伏為主。

偏頭痛模型組2 h內搔頭次數(shù)與正常組、風熱組、中藥治療組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；偏頭痛風熱證組2 h內搔頭次數(shù)與正常組、風熱組、中藥治療組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；正常組與風熱組2 h內搔頭次數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；偏頭痛風熱證組與偏頭痛模型組2 h內搔頭次數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組2 h內搔頭次數(shù)比較(±s) 次

2.3 芎芷地龍湯對偏頭痛風熱證實驗動物模型NO/NOS/cGMP通路的影響 偏頭痛模型組血漿NOS、NO、cGMP含量升高，與正常組、風熱組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；偏頭痛風熱證組血漿NOS、NO、cGMP含量繼續(xù)升高，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)過治療后血漿NOS、NO、cGMP含量恢復，與偏頭痛風熱證組及偏頭痛模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組血漿中NOS、NO、cGMP含量比較(±s)

3 討 論

研究表明NO 是一種細胞內信使，在中樞傷害性感受傳遞中發(fā)揮著重要作用[12，13]。NO由L-精氨酸經(jīng)NOS的催化作用而產(chǎn)生，NO作為第一信使激活胞漿sGC，增加cGMP生成，再激活蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)，使有關蛋白或酶類的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化，從而松弛血管平滑肌，擴張血管；cGMP也作為第二信使和神經(jīng)遞質，使局部神經(jīng)肽-降鈣素基因相關肽反復釋放；cGMP作為第二信使激活第三信使細胞癌基因c-fos，激活靶基因特異DNA序列，調節(jié)基因的轉錄，從而產(chǎn)生對機體長時程的生理效應。c-fos表達將外界刺激引起的第二信使介導的短時程信號在基因表達上轉換成長時程信號，在痛覺引起的突觸可塑性變化中起重要作用[14]。在物理因素和化學因素刺激下，軟腦膜的eNOS陽性內皮細胞產(chǎn)生NO，大腦內的小動脈和毛細血管(例如大腦動脈和微動脈)擴張，引起典型偏頭痛的發(fā)生，同時輕度增加腦血流并降低腦血管阻力[15]。分布于大腦動脈和穿通動脈的nNOS免疫陽性副交感神經(jīng)的節(jié)后(硝基能)纖維、含nNOS神經(jīng)元的谷氨酸能纖維和星形細胞(產(chǎn)生NO的一個可能位點或神經(jīng)血管信號傳導的中介物)也在血管周圍釋放NO[4]。在三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)核)可檢測到來源于血管內皮細胞、神經(jīng)元、星型膠質細胞的NO，NO可促使CGRP和神經(jīng)遞質釋放，進而引起血管擴張或神經(jīng)信號的傳遞[16]。反過來，CGRP使血管的eNOS活化產(chǎn)生NO，NO彌散入血管平滑肌激活鳥苷酸環(huán)化酶，導致cGMP形成，進而使細胞內Ca2+降低，引起血管舒張[1，17]。在人類，在NO供體誘發(fā)的頭痛期間，CGRP血漿水平升高[18]，在動物，NO促使CGRP從硬腦膜血管周傳入神經(jīng)和三叉神經(jīng)核釋放，而由神經(jīng)元和三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質細胞釋放的NO，向三叉神經(jīng)周圍神經(jīng)元傳遞信號[19]。

本實驗觀察到偏頭痛模型組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組大鼠皮下注射硝酸甘油后5 min表現(xiàn)出煩躁，活動增多，前肢及后肢頻繁搔頭，雙耳耳廓血管較正常組增粗，且血管增長直抵耳緣，結膜血管紋路明顯，中藥治療組煩躁、搔頭的表現(xiàn)較硝酸甘油組及風熱硝酸甘油組少，3組在1 h時基本安靜蜷臥，其后間斷活動，以蜷伏為主。正常組與風熱組皮下注射生理鹽水后亦有搔頭表現(xiàn)，數(shù)量較其余3組少，耳廓變紅，但血管較細，結膜血管脈絡較其他3組稀疏，無活動增多，基本蜷臥于籠中。本實驗動物行為改變符合文獻描述，在時間上有所縮短。同時表明芎芷地龍湯能明顯改善偏頭痛動物模型的行為學癥狀，減少動物的陽性反應次數(shù)，具有一定的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用，符合課題組前期研究結論。對于耳廓與眼結膜的研究，偏頭痛模型組、偏頭痛風熱證組、中藥治療組耳廓漫紅，結膜血管紋路明顯，而正常組與風熱組耳廓整體顏色較淡，結膜脈絡無其他3組明顯，體現(xiàn)了硝酸甘油的對耳廓、結膜血管的擴血管作用。

本研究還提示動物在皮下注射硝酸甘油后血漿NOS、NO、cGMP含量升高，偏頭痛模型受風熱因素侵襲后，血漿NOS、NO、cGMP含量持續(xù)升高，經(jīng)藥物干預后，血漿NOS、NO、cGMP含量回復。通過研究模型動物搔頭次數(shù)及血漿中NOS、NO、cGMP含量發(fā)現(xiàn)，風熱對正常組無影響，而對硝酸甘油致偏頭痛模型病理狀態(tài)組有顯著影響，正如《靈樞·百病始生》所言：“風雨寒熱，不得虛，邪不能獨傷人；卒然逢疾風暴雨而不病者，蓋無虛，故邪不能獨傷人；此必因虛邪之風，與其身形，兩虛相得，乃客其形”。當機體接受硝酸甘油后，機體功能紊亂，再給予風熱干預后，容易發(fā)病，如《素問·評熱痛論》曰“邪之所湊，其氣必虛”。給予芎芷地龍湯后，能明顯改善偏頭痛動物模型的行為學癥狀，使血漿中NOS、NO、cGMP含量水平趨于正常水平，表明芎芷地龍湯通過發(fā)揮其祛風通絡活血作用，進而調節(jié)機體失衡狀態(tài)水平，達到治療偏頭痛的作用。

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(本文編輯 郭懷印)

Effect of Xiongzhi Dilong Decoction on NO，NOS and cGMP in Migraine Model with Wind-heat Syndrome

Zhao Yonglie，Wang Yulai，Yao Zhuoting，Yue Guangxin

Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China

Objective To study the effects of Xiongzhi Dilong decoction(XDD) on nitric oxide (NO)/NO synthase (NOS)/cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in migraine with wind-heat syndrome.Methods The migraine model with wind-heat syndrome was established by combining exterior pathogen(hot wind) and GTN administration.The frequency of scratching head within 2 h was examined.The contents of plasma cyclic cGMP， NO and NOS were assayed by radioimmunoassay(RIA)， nitrate reductase method and colorimetric method.Results The contents of plasma NOS，NO，and cGMP in migraine model were significantly higher than that in normal group and wind-heat group(P<0.01)，and the contents of plasma NOS，NO and cGMP in migraine with wind-heat syndrome model persistently increased，which was significant difference compared to normal group(P<0.01)，and was significant difference compared to migraine model group(P<0.05).The contents of plasma NOS，NO and cGMP in Chinese medicine treatment group were recovered，which was significant difference compared to migraine with wind-heat syndrome model and migraine model group(P<0.05).Conclusion There is no significant effect on normal organism which sufferd from wind-heat，but there is significant effect on migraine model induced by nitroglycerin.The content of plasma NOS，NO and cGMP in migraine model which is invaded by wind and heat persistently increased.XDD can attenuate remarkably the contents of plasma NOS，NO and cGMP in migraine model with wind-heat syndrome.

migraine；wind-heat syndrome；Xiongzhi Dilong decoction；nitric oxide； nitric oxide synthase；cyclic guanosine monophosphate

國家自然科學基金項目(No.81373591)

1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院(北京 100078)，E-mail：yongy3@126.com；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院(北京 100029)；3.中國中醫(yī)科學院

R747.2 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．005

1672-1349(2015)10-1165-04

2015-05-30)