胡 芮，姜惠萍，宋亞楠，劉萬順，韓寶芹

1 中國海洋大學海洋生命學院，青島 266003;2 青島博益特生物材料股份有限公司，青島 266101

羧甲基殼聚糖是一種水溶性殼聚糖衍生物，在止血、抗菌和愈創(chuàng)方面具有顯著的生物活性［1］。鋅離子為人體所必須微量元素之一，參與組成80 多種酶或者作為酶的激活劑［2］，研究表明傷口處富集的鋅離子與多種酶活性相關(guān)，從而加速傷口愈合［3］。以往對于羧甲基殼聚糖鋅的研究多集中于其形成機理和抗菌活性:羧甲基殼聚糖與鋅離子可以通過Zn離子與O 和N 離子形成的Zn-O 和Zn-N 鍵形成一種水不溶性的絡(luò)合物［4］，形成的羧甲基殼聚糖鋅對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有比羧甲基殼聚糖更強的抑菌效果［5］。由于羧甲基殼聚糖鋅具有多糖鏈的大分子性質(zhì)、羧甲基殼聚糖和鋅離子的促愈合活性和抗菌活性，所以被認為是一種極具潛力的生物創(chuàng)傷敷料，但有關(guān)羧甲基殼聚糖鋅生物安全性的研究尚未報道，已有研究表明由于絡(luò)合物和金屬離子存在某種化學平衡，殼聚糖金屬絡(luò)合物中的微量金屬元素既可以保持活性并能減低毒性［2］。本試驗就兩種不同絡(luò)合量的羧甲基殼聚糖鋅為試驗材料，制取浸提液，研究其亞急性毒性，旨在為其生物安全性提供依據(jù)。

1 實驗材料

實驗動物:昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)20140001，30 只，雌雄各半，體重為20～25 g，購自青島市實驗動物和動物生產(chǎn)中心，實驗開始前暫養(yǎng)5 d，自由飲水飲食，適應環(huán)境。

實驗材料:兩種不同絡(luò)合量的羧甲基殼聚糖鋅由本實驗室制備，羧甲基殼聚糖與鋅離子的絡(luò)合摩爾比分別為40∶1(高絡(luò)合量)和60∶1(低絡(luò)合量)。相關(guān)血清生化指標試劑盒均購于南京建成股份有限公司，其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司分析純商品試劑。

2 實驗方法

2.1 材料浸提液制取

根據(jù)國標醫(yī)療器械生物學評價第12 部分制取材料浸提液，分別取兩種羧甲基殼聚糖鋅試驗材料，除去吸收容量外，以0.1 g/mL 比例用無菌生理鹽水37 ℃浸提24 h，制得材料浸提液［6］。

2.2 實驗分組及給藥

將30 只昆明種小鼠隨機分為3 組，實驗組1、實驗組2、對照組，每組10 只，雌雄各半。實驗組1小鼠腹腔注射高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅材料浸提液，實驗組2 小鼠腹腔注射低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅材料浸提液，對照組小鼠腹腔注射0.9% NaCl 溶液，各組小鼠每日腹腔注射1 mL，連續(xù)注射28 d［7］。

2.3 小鼠生理狀態(tài)觀察

小鼠自由飲水飲食，每天觀察記錄各組小鼠生理狀況，每隔3～4 d 稱量記錄小鼠體重。

2.4 相關(guān)血液生化指標測定

在28 d 給藥完成時，小鼠空腹過夜，稱重后眼球取血，離心取血清，測定血液常規(guī)生化指標(谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、堿性磷酸酶ALP、總蛋白TP、白蛋白ALB、葡萄糖GLU、尿素氮BUN、肌酐CREA、尿酸UA、甘油三酯TG)［8］。

2.5 臟器指數(shù)測定

進行常規(guī)解剖檢查，取心、肝、脾、肺、腎和胸腺，稱重后計算相應器官指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重)

2.6 病理學檢查

稱重后的各器官于中性甲醛固定2 d 后，經(jīng)過脫水、透明、包埋和切片后，進行HE 常規(guī)染色，顯微鏡下進行常規(guī)病理組織學檢查［9］。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果與討論

3.1 小鼠生理狀態(tài)及體重

各組小鼠在實驗過程中生理活動正常，包括外觀體征、行為活動、腺體分泌、精神狀態(tài)、呼吸、糞便等，實驗組1 和實驗組2 小鼠與對照組小鼠無明顯差別。精神狀態(tài)呼吸均正常，生理狀態(tài)均良好，無中毒及死亡現(xiàn)象。各組小鼠體重變化見表1，可見實驗組1 和實驗組2 小鼠體重與對照組比較，雌雄小鼠均無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 不同組中小鼠的體重變化(g，n=10，±s)Table 1 Weight changes of mice in different groups(n=10，±s)

表1 不同組中小鼠的體重變化(g，n=10，±s)Table 1 Weight changes of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

表2 不同組中小鼠各臟器指數(shù)(n=10，±s)Table 2 Organ index of mice in different groups(n=10，±s)

表2 不同組中小鼠各臟器指數(shù)(n=10，±s)Table 2 Organ index of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

3.2 小鼠各臟器指數(shù)

小鼠給藥28 d 后的各臟器指數(shù)見表2，可見實驗組1 高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅浸提液腹腔給藥28d 后，雌雄小鼠各臟器指數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。實驗組2 低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅浸提液腹腔給藥28d 后，雌性小鼠腎指數(shù)高于對照組腎指數(shù)，有顯著性差異(P＜0.05)，雄性小鼠腎指數(shù)與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。其它臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。實驗組2 雌性小鼠腎指數(shù)高于對照組，浸提液對腎的影響情況應結(jié)合血液生化指標和病理切片進行分析。

3.3 小鼠血液生化指標測定結(jié)果

給藥28d 后，小鼠血清生化指標測定結(jié)果見表3，實驗組1 給藥高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅雄性小鼠血清中ALP、UA 含量均低于對照組，呈顯著性差異(P＜0.05)，其它生化指標與對照組比較無顯著性差異。實驗組2 給藥低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅雄性小鼠血清中UA 含量低于對照組，呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，其它生化指標與對照組比較無顯著性差異。尿酸和堿性磷酸酶低于正常值，是否有病理學意義還需要結(jié)合肝、腎病理切片進行分析。

表3 不同組中小鼠血液生化指標測定結(jié)果(n=10，±s)Table 3 Blood biochemical index determination results of mice in different groups(n=10，±s)

表3 不同組中小鼠血液生化指標測定結(jié)果(n=10，±s)Table 3 Blood biochemical index determination results of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

3.4 小鼠器官解剖觀察

小鼠解剖過程中實驗組各器官與正常組相比，其外觀顏色、顏色和臟器大小均表現(xiàn)正常，未見明顯滲出、增生、水腫、萎縮等病變，結(jié)果全部在正常形態(tài)學范圍內(nèi)，未見明顯病理改變。

圖1 實驗組1(A)、實驗組2(B)及空白對照組(C)中小鼠各器官病理切片觀察(×400)Fig.1 Organ pathological observation of mice in group 1(A)，group 2(B)and control(C)(×400)

3.5 小鼠各器官病理切片觀察

由各器官組織病理切片(見圖1)可見雌雄小鼠心、肝、脾、肺、腎和胸腺病理切片均顯示的組織結(jié)構(gòu)正常，組織內(nèi)部均未出現(xiàn)壞死、腫大，未見炎癥細胞，細胞形態(tài)均正常清晰，未見明顯病理改變。

在整個實驗過程，3 個組的雌雄小鼠毛色、精神狀態(tài)、飲食飲水量、排泄量等生理狀態(tài)均表現(xiàn)正常，無明顯區(qū)別，實驗組雌雄小鼠體重與對照組無顯著性差異，說明材料對小鼠生理機能無明顯影響作用。

從各臟器指數(shù)和血液生化指標測量結(jié)果可以看出，實驗2 組雌性小鼠腎指數(shù)顯著高于對照組腎指數(shù)，實驗1 組雄性小鼠血液中堿性磷酸酶、尿酸含量低于對照組、實驗2 組雄性小鼠尿酸在血清中含量低于對照組，但兩組雌雄小鼠肝、腎組織病理檢查均顯示組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)未發(fā)生改變，綜合結(jié)果表明無病理意義。結(jié)果表明羧甲基殼聚糖鋅無明顯亞急性毒性，但實驗組雄性小鼠血清中堿性磷酸酶降低、尿酸降低的原因還需要進行深入研究。

4 結(jié)論

鋅離子為人體生命活動中不可或缺的微量元素，但是過量的鋅對機體有損害作用，有研究表明高劑量鋅可以導致大鼠學習能力下降［10］，并且導致機體不孕不育，小鼠鋅中毒后也會表現(xiàn)食欲下降、皮毛失去光澤，運動量和運動能力下降［11］。鋅的毒性作用與其形成化合物的形式和鋅離子含量等因素有關(guān)。鋅鹽的種類分為無機鋅和有機鋅，不同形式的鋅鹽的對不同生物的毒性劑量不同，之前有關(guān)于鋅離子的毒性評價研究多著重于攝入性毒性，研究表明人的食物中鋅的最高允許劑量為40～60 mg/kg，有機鋅與無機鋅相比生物學效價更高，更易被生物體吸收利用，因此更容易導致鋅中毒［12］。然而對于其作為醫(yī)用材料組成成分，關(guān)于鋅離子腹腔毒性的實驗鮮有報道。羧甲基殼聚糖是一種天然大分子材料，有研究表明它無亞慢性攝入毒性［13］、無急性攝入毒性［14，15］、擁有較好的生物相容性，實驗中利用羧甲基殼聚糖優(yōu)異的生物學特性和較強的金屬配位能力，與不同比例鋅離子反應生成了屬于多糖鋅復合物的羧甲基殼聚糖鋅，研究了制得材料浸提液通過腹腔注射對小鼠的亞急性毒性，結(jié)果表明試驗中所制得的兩種材料無明顯亞急性毒性，為羧甲基殼聚糖鋅成為一種可以載體內(nèi)應用的生物材料提供了基礎(chǔ)。

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