朱玉鳳，薛 敏，段 煜

濰坊醫(yī)學院藥學院，濰坊 261053

營養(yǎng)學和流行病學研究表明黃酮的攝入量與心血管疾病的發(fā)生率呈反比關(guān)系［1-3］。槲皮素日攝入量約占黃酮日總攝入量的60%［4］。槲皮素具有顯著的抗血小板聚集活性［5-9］，這與其防治心血管疾病有直接的相關(guān)性，因此，槲皮素在制備防治心血管疾病的功能食品和藥物中具有廣泛的應用前景。然而，槲皮素在各類溶劑中的溶解性低、穩(wěn)定性差，特別是在水中幾乎不溶，這些性質(zhì)影響了槲皮素的生物利用度和應用。

槲皮素的溶解性差，部分由于其平面的分子構(gòu)型。分子間緊密堆砌，不利于溶劑進入分子間隙。通過?；纹に氐牧u基將短脂肪烴基鏈引入槲皮素能破壞這種分子排列，從而改善溶解性。槲皮素的活性基團包括B 環(huán)的鄰二酚羥基和C 環(huán)的4 位羰基及2、3 位間的雙鍵［10，11］。保持這些活性基團完好，通過區(qū)域選擇性?；瑢⒍讨緹N基鏈引入槲皮素的3 位羥基，這是改善溶解性而保持生物活性的最佳方法。Saija 等和Montenegro 等的研究表明，將短脂肪烴基鏈引入槲皮素的3 位羥基不僅賦予槲皮素衍生物適宜的物理化學性質(zhì)，而且保持了槲皮素的抗氧化性［12，13］。

目前，黃酮類化合物的區(qū)域選擇性?；嗖捎妹阜ɑ蚧瘜W-酶結(jié)合法［14-20］，而較少采用傳統(tǒng)的化學?；?。這是由于采用傳統(tǒng)的化學?；?，黃酮類化合物的多位羥基都可能被?；甚；旌衔?，導致生物活性降低甚至喪失。然而，目前有很多關(guān)于采用傳統(tǒng)化學法合成其他類黃酮衍生物的報道，報道中均采用“活性基團保護-衍生化-去保護”的合成路線［21-24］。該合成路線為采用傳統(tǒng)化學酰化法合成黃酮區(qū)域選擇?；苌锾峁┝擞袃r值的參考。

為了改善槲皮素的水溶性而不影響其抗血小板聚集活性，本文中以蘆丁作為原料，采用“芐化-水解-?；?加氫還原”四步化學合成法，合成了兩個槲皮素?；苌?槲皮素-3-O-乙酸酯(Q-ac)和槲皮素-3-O-丙酸酯(Q-pr)，并用反相色譜法測定了這兩個衍生物的水溶性，同時，采用體外和體內(nèi)動物實驗初步測定了這兩個衍生物抗二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集活性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器:半制備高效液相色譜儀(Agilent1200，美國Agilent 公司)，核磁共振儀(AVANCE 600，法國Bruker 公司)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6410，美國Agilent 公司)，分析型高效液相色譜儀(LC-20AT，日本Shimadzu 公司)，血小板聚集儀(LBYNJ4A，北京普利生儀器有限公司)。

試劑:蘆丁(≥98%)，生化試劑，購自南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所，臨用前在110 ℃、1.3×103Pa下放置12 h 去除結(jié)晶水;乙酸酐和丙酰氯，均為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司;溴化芐，化學純，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司，臨用前重蒸;三乙胺，分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公式，臨用前脫水;ADP，生化試劑，Sigma 公司產(chǎn)品，用前溶于生理鹽水中;鈀炭催化劑，10%，國藥集團化學試劑有限公司;其他化學試劑購自當?shù)鼗瘜W試劑供應商。

1.2 實驗動物

新西蘭兔，體重2.0～3.0 kg，雄性，由山東魯抗制藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號:魯實動證字0017075 號。

Wistar 大鼠，體重250～300 g，雄性，由山東魯抗制藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號:魯實動證字0010061 號。

所有動物實驗均獲得濰坊醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 Q-ac、Q-pr 的合成

以蘆丁為原料，采用四步合成路線“芐化-水解-?；?加氫還原”制備Q-ac 和Q-pr。

第一步，芐化。根據(jù)Wuts 報道的方法［25］，蘆丁(24.42 g，40 mmol)和無水K2CO3(18.35g，133 mmol)依次在氮氣氛下加入到160 mL 的DMF 中，室溫下攪拌1 h，之后緩慢滴加溴化芐(16 mL，133 mmol)。滴加完畢后，于氮氣氛下40 ℃攪拌反應3 h。反應完畢后，在冰浴下用10 %(體積比)的乙酸溶液調(diào)pH 為6.0，之后加入300 mL 去離子水，離心，棄上清，沉淀即為芐化產(chǎn)物。

第二步，水解。將芐化產(chǎn)物溶于600 mL 95 %(體積比)的乙醇中，加入90 mL 36 %(質(zhì)量比)的濃鹽酸，70 ℃下回流水解2 h。過濾，濾餅用去離子水洗至中性即得水解產(chǎn)物。

第三步，?；Ｋ猱a(chǎn)物溶于200 mL 的DMF中，加入乙酸酐(44 mmol)或丙酰氯(44 mmol)和三乙胺(44 mmol)，室溫下攪拌反應。用硅膠60-GF254薄層層析板監(jiān)測反應進程，展開劑，乙酸乙酯/甲醇/乙酸(6∶4∶0.1，體積比)，在波長為254 nm 的紫外光下觀察。反應直到原料點消失為止。加入400 mL 去離子水，過濾，濾餅即為酰化產(chǎn)物。

第四步，加氫還原。酰化產(chǎn)物溶解于5 L 的乙醇/二氧六環(huán)(1∶1，體積比)的混合溶劑中，加入2 g的鈀炭催化劑，氫氣氛下室溫攪拌反應2 h。過濾除去催化劑，濾液真空脫溶劑即得Q-ac 或Q-pr 的粗品。

1.4 Q-ac、Q-pr 的純化

Agilent 1200 半制備高效液相色譜儀用于純化得到Q-ac 和Q-pr 的純品。色譜柱:Agilent ZORBAX-SB C18半制備柱(250×9.4 mm，5 μm)。色譜條件:上樣量200 μL;流速5 mL/min;柱溫室溫;流動相組成，Q-ac，乙腈/水(40∶60，體積比)，Q-pr，乙腈/水(30∶70，體積比);254 nm 紫外檢測。

1.5 水溶性的測定

槲皮素、Q-ac 和Q-pr 水溶性的測定依據(jù)Bonina等采用的方法［26］。具體為，過量的化合物溶解于含2 mL 去離子水的玻璃瓶中，聚四氟乙烯塞子密封，室溫下磁力攪拌24 h，過濾。濾液為化合物的飽和水溶液，其濃度用Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀測定，檢測重復10 次。色譜柱:Shimadzu Shimpack VP-ODS C18色譜柱(250×4.60 mm，5 μm)。色譜條件:上樣量20 μL;流速1 mL/min;柱溫室溫;流動相組成，水/甲醇(30∶70，體積比);254 nm 紫外檢測。

1.6 抗血小板聚集活性的測定

1.6.1 體外實驗

富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備依據(jù)文獻［27］，具體為，新西蘭兔頸動脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑的體積比為9∶1)，收集于塑料離心管中，室溫下以1400 rpm 離心8 min，取上層液即為PRP，剩余血液繼續(xù)以4000 rpm離心15 min，取上層液即為PPP。測定時，用PPP 調(diào)PRP 中的血小板數(shù)為約5×108cell/mL。

比濁法測定血小板聚集率［27］。首先用300 μL的PPP 調(diào)零，之后比濁管中加入300 μL 的PRP，藥物組分別加入不同濃度的槲皮素、Q-ac 及Q-pr 的二甲基亞砜(DMSO)溶液各3 μL(DMSO 的終體積不得超過1.0%，防止引起假陽性結(jié)果)，陰性對照組加入3 μL 的DMSO。37℃孵育5 min 后，加入ADP溶液，使其終濃度為7 μmol/L，記錄5 min 內(nèi)的最大聚集率。血小板聚集抑制率按下式計算:抑聚率(%)=［(1-藥物組聚集率/陰性對照組聚集率)］×100

1.6.2 體內(nèi)實驗

Q-ac、Q-pr 和槲皮素分別溶解于30%的丙二醇水溶液中。

Wistar 大鼠隨機分為4 組，每組8 只。Q-ac 組、Q-pr 組、槲皮素組分別尾靜脈注射給藥，劑量參照文獻［7］，均為30 μmol/kg。陰性對照組，尾靜脈注射0.5 mL 30%的丙二醇水溶液。給藥30 min 后，心臟取血。血樣處理和血漿制備與體外實驗相同。

比濁法測定血小板聚集率。首先用300 μL 的PPP 調(diào)零，之后比濁管中加入300 μL 的PRP，37 ℃孵育5 min 后，加入ADP 溶液，使其終濃度為7 μmol/L，記錄5 min 內(nèi)的最大聚集率。血小板聚集抑制率的計算同體外實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素的區(qū)域選擇性?；?/h3>

槲皮素分子中有五個化學性質(zhì)相似的羥基，為確保酰化選擇性發(fā)生在槲皮素的3 位羥基，我們選用蘆丁為原料，采用了“活性基團保護-衍生化-去保護”的合成策略。合成路線包括四個步驟，見圖1。

圖1 槲皮素3-O-酰化衍生物的合成路線Fig.1 The four step synthetic route of quercetin-3-O-acylated derivatives

第一步，芐化。加入3.3 倍摩爾量的無水K2CO3作為催化劑，使槲皮素的3'、4'和7 位羥基形成氧負離子，而5 位羥基與4 位羰基形成分子內(nèi)氫鍵而無法形成氧負離子［28］。加入3.3 倍摩爾量的芐化溴，使氧負離子形成芐氧基，生成3'，4'，7-O-三芐基蘆丁。為了避免產(chǎn)生C-烷基化的衍生物，非質(zhì)子溶劑DMF 作為反應溶劑。第二步，水解3'，4'，7-O-三芐基蘆丁的苷鍵，暴露3 位羥基。第三步，?；?。雖然3 位和5 位的羥基均有可能與4 位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，但是氫鍵具有方向性和飽和性，5 位羥基更容易形成分子內(nèi)氫鍵而呈現(xiàn)反應惰性［29］。加入稍微過量即1.1 倍摩爾量的三乙胺作為堿性催化劑和1.1 倍摩爾量的?；w(乙酸酐或丙酰氯)，僅3 位羥基發(fā)生酰化，生成3'，4'，7-O-三芐基-3-O-?；纹に亍５谒牟?，加氫還原反應脫去3'、4'、7 位的芐基，生成槲皮素3-O-?；苌锏拇之a(chǎn)物。

半制備型高效液相色譜純化粗產(chǎn)物，得到兩個高度純化的Q-ac 和Q-pr，其產(chǎn)率分別為75%，81%，均為黃色粉末。

2.2 ?；苌锏慕Y(jié)構(gòu)表征

?；苌镏兄觉；臄?shù)量和位置由1H NMR、13C NMR 和MS 譜進行了表征。

1H NMR 譜中，兩個?；苌锏?'位、4'位、7位和5 位羥基中的活潑質(zhì)子都消失了，這是3-取代槲皮素的顯著特征，如蘆丁。13C NMR 譜中，Q-ac 和Q-pr 的酯羰基碳的化學位移分別在168.50 ppm 和171.78 ppm，這表明成功將脂肪酰基引入槲皮素;槲皮素3 位碳的化學位移在136.18 ppm，而Q-ac 和Q-pr 3 位碳的化學位均向高頻移動，分別在130.06 ppm 和130.06 ppm;此外，槲皮素2 位碳的化學位移在147.30 ppm，而Q-ac 和Q-pr 2 位碳的化學位移均向低頻移動，分別在150.32 ppm 和156.36 ppm;衍生物和槲皮素的其它碳的化學位移相同。上述分析表明，酰化選擇性地發(fā)生在槲皮素的3 位羥基。(見圖1)。

?；苌锏腗S 譜進一步證實了其分子結(jié)構(gòu)。對于Q-ac，367.1 m/z 分子離子峰與Q-ac 和Na+的分子量之和相一致;對于Q-pr，381.1 m/z 分子離子峰與Q-pr 與Na+的分子量之和相一致。

槲 皮 素，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:12.50(1H，s，5-OH)，10.77(1H，s，7-OH)，9.35(3H，br s，3，3'，4'-OH)，7.68(1H，d，H-2')，7.55(1H，dd，H-6')，6.89(1H，d，H-5')，6.41(1H，d，H-8)，6.19(1H，d，H-6);13C NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:176.31(C-4)，164.35(C-7)，161.20(C-9)，156.62(C-5)，148.17(C-4')，147.30(C-2)，145.53(C-3')，136.18(C-3)，122.44(C-1')，120.44(C-6')，116.07(C-5')，115.56(C-2')，103.49(C-10)，98.65(C-6)，93.81(C-8).

Q-ac，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:7.33(1H，d，H-2')，7.27(1H，d，H-6')，6.92(1H，d，H-5')，6.48(1H，d，H-8)，6.25(1H，d，H-6)，2.68(2H，t，CH2)，1.15(3H，t，CH3);13C NMR(DMSOd6，600 MHz)δ:175.41(C-4)，168.50(C=O)，165.18(C-7)，161.58(C-9)，156.72(C-5)，150.32(C-2)，148.27(C-4’)，146.22(C-3')，130.06(C-3)，122.98(C-1')，121.12(C-6')，116.51(C-5')，115.46(C-2')，103.71(C-10)，98.85(C-6)，94.75(C-8)，20.80(CH3);ESI-MS m/z 367.1(calcd for C17H12O8·Na+，367.1)。

Q-pr，1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，10.67(1H，br，s，7-OH)，9.72(3H，br s，3，3'，4'-OH)，7.33(1H，d，H-2')，7.27(1H，d，H-6')，6.92(1H，d，H-5')，6.48(1H，d，H-8)，6.25(1H，d，H-6)，2.68(2H，t，CH2)，1.15(3H，t，CH3);13C NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:175.39(C-4)，171.78(C=O)，165.18(C-7)，161.54(C-9)，157.08(C-5)，156.36(C-2)，149.78(C-4’)，145.95(C-3')，130.06(C-3)，120.98(C-1')，120.08(C-6')，116.45(C-5')，115.46(C-2')，103.89(C-10)，99.55(C-6)，94.56(C-8)，27.08(CH2)，9.32(CH3);ESI-MS m/z 381.1(calcd for C18H14O8·Na+，381.1)

2.3 Q-ac 和Q-pr 的水溶性

Q-ac、Q-pr 和槲皮素的色譜保留時間分別為5.2 min、10.13 min 和7.3 min，見圖2。

圖2 Q-ac(a)、Q-pr(b)和槲皮素(c)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Q-ac(a)，Q-pr(b)and quercetin(c)

經(jīng)測定，Q-ac、Q-pr 及槲皮素在水中的溶解度分別為243.27±19.27 μg/mL、8.13±0.88 μg/mL和1.98±0.11 μg/mL。Q-ac 的水溶性遠大于槲皮素，溶解度是槲皮素的122.9 倍。Q-pr 的溶解度也大于槲皮素，且具有顯著性差異(P＜0.001)。說明，通過區(qū)域選擇性?；陂纹に氐? 位羥基引入短脂肪烴鏈能顯著增加水溶性，這與Saija 等和Montenegro 等的研究結(jié)果相似［12，13］。這很可能是因為短脂肪烴基鏈破壞了槲皮素分子間的緊密堆砌，溶劑更容易進入分子間隙，從而增大溶解性。隨著脂肪烴基鏈增長，疏水性增大，衍生物的水溶性下降，因此Q-pr 的溶解度小于Q-ac。

Q-ac、Q-pr 及槲皮素在水中的溶解度與參考文獻［12，13］不一致。可能是由于色譜條件不同。Saija等［12］采用水/乙腈/四氫呋喃/三氟乙酸(58.8∶40∶1.2∶0.06)為流動相，紫外檢測波長為254 nm，Montenegro 等［13］采用乙腈/0.17 mol/L 的醋酸(35∶65)為流動相，紫外檢測波長為350 nm。對于難溶甚至不溶的槲皮素及槲皮素-3-O-脂肪酸衍生物，出峰的強度與其在流動相中的溶解度及紫外吸收波長有直接關(guān)系。雖然各種條件下測定的結(jié)果均不同，但都能得到結(jié)論:通過?；瘜⒍讨咎兼溡腴纹に? 位能夠改善水溶性。

2.4 抗血小板聚集活性

通過體外和體內(nèi)動物實驗初步評價了Q-ac、Qpr 和槲皮素抗ADP 誘導的血小板聚集，實驗結(jié)果見圖3 和圖4。

圖3 Q-ac、Q-pr 和槲皮素體外抗ADP 誘導的血小板聚集(n=6)Fig.3 Q-ac，Q-pr and quercetin inhibited platelet aggregation induced by ADP in vitro(n=6)

圖4 Q-ac、Q-pr 和槲皮素體內(nèi)抗ADP 誘導的血小板聚集(n=6)Fig.4 Q-ac，Q-pr and quercetin inhibited platelet aggregation induced by ADP in vivo(n=6)

?；瘏^(qū)域選擇性地發(fā)生在槲皮素的3 位羥基，而其它活性基團沒有變化，預期衍生化不會影響抗血小板聚集活性。實驗結(jié)果正如我們預期，在體外實驗中，Q-ac 和Q-pr 均能抑制ADP 誘導的血小板聚集，抑聚率均呈良好的濃度依賴性(見圖3)。Qac、Q-pr 和槲皮素的體外IC50分別為94.1 μmol/L、204.9 μmol/L 和255.7 μmol/L。Q-ac 和Q-pr 的IC50均小于槲皮素，其中Q-ac 最小，其次為Q-pr。體內(nèi)實驗中，Q-ac 和Q-pr 的抑聚率均大于槲皮素的抑聚率(見圖4)。體外和體內(nèi)實驗均表明，Q-ac 和Q-pr 比它們的前體槲皮素具有更顯著的抗血小板聚集活性。這大概是由于Q-ac 和Q-pr 具有適當?shù)乃苄?，利于它們遷移穿過水性環(huán)境插入到血小板的生物膜，并定位于疏水內(nèi)核。Saija 等人用差示掃描量熱法研究了Q-ac、Q-pr、槲皮素-3-O-棕櫚酸酯與二磷酸膽酰堿多層囊泡、單層囊泡的相互作用，認為，引入短脂肪烴基鏈使槲皮素衍生物具有了適宜的物化性質(zhì)，能夠遷移通過水性環(huán)境，并與雙層膜發(fā)生相互作用［12］。這很可能是Q-ac 和Q-pr 具有比槲皮素更強的抗血小板聚集活性的原因。

3 結(jié)論

槲皮素具有顯著的抗血小板聚集活性，本研究用含有短脂肪烴基鏈的酰基供體選擇性?；纹に氐? 位羥基，生成的衍生物Q-ac 和Q-pr 具有更高的水溶性和更強的抗血小板聚集活性，對開發(fā)槲皮素為防治心血管疾病的功能性食品和藥物具有研究和應用意義。

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