余興東，魏 華

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)外周紅細(xì)胞微核和核異常的影響

余興東，魏 華?

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

本文采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法與微核測(cè)定法，研究4種不同濃度阿特拉津（0、0.5、5.0和10.0 mg/L）在不同暴露時(shí)間（1、3、6和9 d）對(duì)斑馬魚(yú)外周血紅細(xì)胞微核與核異常的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，阿特拉津處理組出現(xiàn)了較多微核、核質(zhì)外凸與內(nèi)凹、核固縮、核不均等縊縮等核異?，F(xiàn)象;阿特拉津處理組的微核率和核異常率隨阿特拉津暴露濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升。而丙酮對(duì)斑馬魚(yú)的微核和核異常無(wú)明顯影響。上述結(jié)果說(shuō)明，阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)具有潛在的遺傳毒性，且毒性效應(yīng)在一定的條件下隨暴露濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

阿特拉津；斑馬魚(yú)；紅細(xì)胞；微核；核異常

阿特拉津（At razine,At r）是我國(guó)目前廣泛使用的一種除草劑，其能通過(guò)地表徑流、淋溶、干/濕沉降等方式進(jìn)入水體，從而對(duì)水生生態(tài)環(huán)境和人類飲用水源造成潛在的污染。近年來(lái)，因其使用量大、殘留期長(zhǎng)、環(huán)境水體中檢出率高而受到使用限制。研究發(fā)現(xiàn)，海水中3 g/L的阿特拉津可以使橈足類動(dòng)物的繁殖力降低，殺死水底節(jié)肢動(dòng)物，破壞水體生態(tài)平衡[1]。阿特拉津也會(huì)影響蛙類等兩棲動(dòng)物的形態(tài)發(fā)育，使魚(yú)體內(nèi)重要的生理功能發(fā)生紊亂[2-3]。在鼠類中3 g/L的阿特拉津使倉(cāng)鼠染色體破裂，在一定劑量下可對(duì)小鼠生殖細(xì)胞產(chǎn)生遺傳損傷，且干擾精子的正常生成與成熟過(guò)程[4-5]。阿特拉津?qū)θ祟愐矔?huì)產(chǎn)生毒性作用，用阿特拉津處理體外培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞，當(dāng)阿特拉津濃度為0.001 g/L時(shí)，淋巴細(xì)胞染色體輕微受損；當(dāng)阿特拉津濃度達(dá)到0.005 g/L時(shí)，染色體發(fā)生顯著損傷[6]。長(zhǎng)期接觸阿特拉津會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生[7]。阿特拉津還會(huì)對(duì)生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生破壞作用，引起一系列病癥，甚至引發(fā)癌癥。本研究以模式生物——斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，選取阿特拉津?yàn)槿径驹噭?，探討了阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞微核和核異常的影響，以期為水產(chǎn)動(dòng)物的毒性研究提供參考，也為合理評(píng)價(jià)阿特拉津的安全性及合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和藥品

1.1.1 試驗(yàn)儀器 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（奧林巴斯BX53）；恒溫箱；載玻片。1.1.2 試驗(yàn)藥品 阿特拉津（上海科興生物科技有限公司）；丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；Giemsa染液（中國(guó)公私合營(yíng)新中化學(xué)廠）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚(yú)（Danio rerio）（3±0.5 cm）購(gòu)買(mǎi)自沈陽(yáng)小津橋花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，在去氯自來(lái)水中馴養(yǎng)5 d，水溫控制在26～30℃，光照周期12 h。剛購(gòu)回的魚(yú)用20 ppm的高錳酸鉀溶液浸泡消毒3 min，然后置于玻璃缸中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間不投喂飼料。待斑馬魚(yú)適應(yīng)環(huán)境后，選擇健康無(wú)病、游動(dòng)正常、大小基本一致、體重相近的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 染毒 采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法對(duì)斑馬魚(yú)染毒，進(jìn)行阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)96 h急性毒性試驗(yàn)，得到96 h LC50值為145.4 mg/L。為保證試驗(yàn)期間藥物對(duì)魚(yú)類的安全性，阿特拉津的試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍設(shè)在1/10的96 h LC50之內(nèi)，具體質(zhì)量濃度為：0、0.5、5、10 mg/L。因阿特拉津難溶于水，需丙酮助溶，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組（0.4 ml/L丙酮）。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)2個(gè)平行組。

將斑馬魚(yú)隨機(jī)分為5組，放入2 L的大燒杯中每個(gè)大燒杯放10尾。對(duì)照組放入魚(yú)后正常加入曝氣的自來(lái)水到1.2 L處，4個(gè)試驗(yàn)組分別裝入阿特拉津濃度為0、0.5、5、10 mg/L的自來(lái)水溶液。另一個(gè)試驗(yàn)組中加入丙酮濃度為0.4 mL/L。各組試驗(yàn)的溫度均為28℃、pH為7.5、溶解氧為5 mg/L。

1.3.2 采血制片及鏡檢計(jì)數(shù) 取樣時(shí)從每組2個(gè)平行樣中各隨機(jī)抽取試驗(yàn)魚(yú)2尾。先用紗布擦干魚(yú)體表面后，斷尾取少量血液，滴入干凈的載玻片上，制成血涂片并晾干。甲醇固定15 min；晾干后轉(zhuǎn)移到盛有體積分?jǐn)?shù)為10%的Giemsa染液的染缸中，染色15 min；取出后立即用蒸餾水進(jìn)行沖洗，晾干后即可用于鏡檢計(jì)數(shù)。

每尾魚(yú)制片2張，用于鏡檢。將4組鏡檢結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。將血涂片置于油鏡（10×100）下觀察、計(jì)數(shù)，每張片子計(jì)數(shù)2 000個(gè)紅細(xì)胞。分別記錄微核和核異常細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以千分率（‰）表示。

計(jì)算公式：Rm＝Nm/Nc；Ra＝Na/Nc；Rt=Rm+ Ra。其中，Nc為每張片子觀察的細(xì)胞數(shù)；Nm為所觀察細(xì)胞中具有微核的細(xì)胞數(shù)；Na為所觀察細(xì)胞中具有核異常的細(xì)胞數(shù)（不含微核細(xì)胞數(shù)）；Rm為微核細(xì)胞率；Ra為核異常細(xì)胞率；Rt為總核異常細(xì)胞率。1.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)分析以SigmastatV 3.1軟件采用one-way ANOVA方差分析及Tukey’s檢驗(yàn)法，組間比較用t-test檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001表示差異的顯著性。采用EXCEL 2010軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常的影響

2.1.1 第1天阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常的影響 根據(jù)圖1可以看出，在試驗(yàn)第1天，不同濃度的阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)的核異常率影響不同。在不同濃度的5組溶液中，隨著阿特拉津濃度的增加，斑馬魚(yú)的核異常率也依次遞增，存在時(shí)間-劑量效應(yīng)。阿特拉津處理組的斑馬魚(yú)紅細(xì)胞核異常率均高于對(duì)照組，對(duì)照組核異常率最低為3.4‰，阿特拉津濃度10 mg/L核異常率最高為8.5‰。其中，較高濃度組（5 mg/L和10 mg/L）的紅細(xì)胞核異常數(shù)量也較高，與對(duì)照組比較有極顯著差異（P＜0.01）（圖中的每組數(shù)值的顯著性都是與0 mg/L的對(duì)照組比較）。

2.1.2 第3天阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常的影響 根據(jù)圖2可以看出，在試驗(yàn)第3天，對(duì)照組的丙酮溶液與0 mg/L的阿特拉津溶液的核率最低，且相差不大，都在5‰以下，說(shuō)明丙酮對(duì)斑馬魚(yú)沒(méi)有什么影響。其他組（5 mg/L核異常率為13‰，10 mg/L核異常率為22‰）隨著阿特拉津溶液濃度的增加細(xì)胞核的異常率也在增加，說(shuō)明阿特拉津溶液濃度越高對(duì)斑馬魚(yú)的遺傳毒性也越大（圖中的每組數(shù)值的顯著性都是與0 mg/L的對(duì)照組比較）。

2.1.3 第6天阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常的影響 根據(jù)圖3可以看出，在試驗(yàn)第6天，不同濃度的阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)的核異常率影響情況也是有差異的。在不同濃度的5個(gè)試驗(yàn)組溶液中，斑馬魚(yú)的核異常率與試驗(yàn)溶液濃度成一定劑量關(guān)系。對(duì)照組核異常率最低為3.25‰，阿特拉津濃度10 mg/L核異常率最高為26.5‰，是對(duì)照組的8倍。其中，較高濃度組（5 mg/L和10 mg/L）的紅細(xì)胞核異常數(shù)量也較高，可見(jiàn)濃度越高對(duì)斑馬魚(yú)的毒性越強(qiáng)（圖中的每組數(shù)值的顯著性都是與0 mg/L的對(duì)照組比較）。

2.1.4 第9天阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常的影響 根據(jù)圖4可以看出，在試驗(yàn)第9天，不同濃度的阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)的核異常率影響情況是隨著阿特拉津溶液濃度的增加細(xì)胞核異常率增加的幅度逐漸降低，但仍呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組核異常率最低為3.2‰，阿特拉津濃度10 mg/L核異常率最高為30‰，幾乎是對(duì)照組的10倍?？梢?jiàn)最高的濃度溶液細(xì)胞微核率與空白組有顯著的差異性（圖中的每組數(shù)值的顯著性都是與0 mg/L的對(duì)照組比較）。

圖1 不同濃度阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常率的影響（‰）（第1天）Fig.1 Effect o f total abnorm al nucleus rate of erythrocytes on Danio rerio by atrazine（‰）（Day 1）注：“*”代表各試驗(yàn)組與Al t 0 mg/L組的差異性，“*”：P＜0.05，代表有顯著性差異；“**”：P＜0.01，代表差異顯著；“***”：P＜0.001，代表差異極顯著。下圖同。

圖2 不同濃度阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常率的影響（‰）（第3天）Fig.2 Effect of total abnormal nucleus rate of erythrocytes on Danio rerio by atrazine（‰）（Day 3）

2.2 阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞形態(tài)的影響 由圖5可見(jiàn)，阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞的不同影響，分別出現(xiàn)微核和各種核異常的形態(tài)。圖5.A是正常狀態(tài)下的斑馬魚(yú)紅細(xì)胞形態(tài)圖，細(xì)胞多呈現(xiàn)橢圓狀，細(xì)胞核位于胞質(zhì)正中心，主核多數(shù)呈卵圓形，少數(shù)呈圓形。核外凸（圖5.B）是細(xì)胞核向外凸起。核質(zhì)固縮（圖5.C）是細(xì)胞核形態(tài)改變從橢圓形變成近似圓形，并縮小。無(wú)核膜（圖5.D）是細(xì)胞核沒(méi)有核膜。核碎裂（圖5.D）是細(xì)胞核在胞質(zhì)中碎裂，呈現(xiàn)分散狀態(tài)。圖5.F是正常細(xì)胞核旁邊有1個(gè)或多個(gè)比正常細(xì)胞核小的核，稱為微核。核位異常（圖5.G）是細(xì)胞核不在細(xì)胞的正中間而偏向于細(xì)胞邊緣。核內(nèi)凹（圖5.H）是細(xì)胞核向內(nèi)凹陷。不均等縊裂（圖5.I）是細(xì)胞核分裂時(shí)大小不均等。

圖3 不同濃度阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常率的影響（‰）（第6天）Fig.3 Effect of total abnorm al nucleus rate o f erythrocytes on Danio rerio by atrazine（‰）（Day 6）

圖4 不同濃度阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞總核異常率的影響（‰）（第9天）Fig.4 Effect of total abnormal nucleus rate of erythrocytes on Danio rerio by atrazine（‰）（Day 9）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 微核是生物在環(huán)境中受到輻射或其他誘變因子作用時(shí)，細(xì)胞間期細(xì)胞核受到損傷而產(chǎn)生的小核。微核來(lái)源于染色體斷裂的片段或整條染色體（組），其形成機(jī)理一般認(rèn)為是具有遺傳毒性的物質(zhì)作用于染色體，導(dǎo)致染色體斷裂，或作用于紡錘體，導(dǎo)致紡錘體功能不全；在細(xì)胞分裂時(shí)，斷片或整條染色體（組）移動(dòng)滯后，從而形成大小不同的微核[8-9]。普遍認(rèn)為，小微核是由染色體斷裂劑打斷染色體產(chǎn)生的無(wú)著絲粒片段形成的；大微核是由紡錘體毒劑打斷紡錘絲，造成一條或一組染色體滯后而形成的[10]。在本次試驗(yàn)中既觀察到了小微核，又觀察到了大微核，還有核質(zhì)分裂、核質(zhì)固縮?？梢?jiàn)，阿特拉津具有染色體斷裂劑和紡錘體毒劑的雙重作用。

關(guān)于微核形成的其他學(xué)說(shuō)，我國(guó)學(xué)者薛開(kāi)先等[11]采用放射自顯影、間期細(xì)胞及各周期微核定量分析等手段，第一次提出了間期細(xì)胞可以以核芽突方式形成微核的學(xué)說(shuō)。樓允東等認(rèn)為主核外突形成微核是可能的，后來(lái)，錢(qián)曉薇[12]也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，從阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)外周血紅細(xì)胞微核和總核異常影響的時(shí)間效應(yīng)來(lái)看，各質(zhì)量濃度條件下的紅細(xì)胞微核率和總核異常率均隨著阿特拉津作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與阿特拉津在魚(yú)體中富集量的變化有關(guān)。孟順龍等[13]發(fā)現(xiàn)阿特拉津在魚(yú)體肝臟、腎臟和肌肉中的富集量是隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高的；且微核率及總核異常率與阿特拉津在魚(yú)體中的富集量有很好的正相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同試驗(yàn)組中丙酮組和0 mg/L的阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)紅細(xì)胞的總核異常率幾乎沒(méi)有差異性?？梢?jiàn)本試驗(yàn)中阿特拉津助溶劑丙酮溶液對(duì)斑馬魚(yú)的遺傳毒性沒(méi)有影響。本試驗(yàn)中，第9天0.5 mg/L的阿特拉津溶液細(xì)胞核異常率是14‰，5 mg/L的阿特拉津溶液核異常率為25.3‰，10 mg/ L的阿特拉津溶液的細(xì)胞微核率為30‰。可見(jiàn)，阿特拉津的濃度與其對(duì)外周紅細(xì)胞核異常率之間存在劑量依賴效應(yīng)，即外周血紅細(xì)胞微核率隨著染毒濃度的增加而上升，這說(shuō)明污染物質(zhì)量濃度越高，遺傳損傷越強(qiáng)。

且在本試驗(yàn)中，同一濃度阿特拉津作用時(shí)間越長(zhǎng)，斑馬魚(yú)的總核異常率就越高。如10 mg/L的溶液第1天微核率為8.5‰，第3天微核率為22‰，幾乎是前一次觀察結(jié)果的3倍，第6天觀察的微核率為26.5‰，是前次觀察結(jié)果的1.2倍多，第9天的時(shí)候微核率為30‰，是前一次觀察的1.1倍多。以上研究結(jié)果均說(shuō)明阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的遺傳性損傷，且損傷程度隨染毒質(zhì)量濃度的增加或污染脅迫時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

A：正常紅細(xì)胞，B：核外凸，C：核質(zhì)固縮，D：無(wú)核膜，E：核裂碎，F(xiàn)：微核，G：核位異常，H：核內(nèi)凹，I：不均等縊裂圖5 阿特拉津所致斑馬魚(yú)紅細(xì)胞微核和核異常示意圖（100×油鏡）Fig.5 Micronucleus and nuclear anomalies in erythocytes of Danio rerio induced by atrazine

3.2 結(jié)論

3.2.1 空白對(duì)照組（0 mg/L阿特拉津）斑馬魚(yú)的外周血紅細(xì)胞總核異常率比較低，且在不同作用時(shí)間下的差異都不顯著，表明用該方法評(píng)價(jià)污染物對(duì)機(jī)體細(xì)胞的遺傳損傷情況是可行的。

3.2.2 阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)外周血紅細(xì)胞總核異常率有一定影響，并在一定條件下存在劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，表明除草劑阿特拉津?qū)Π唏R魚(yú)具有潛在的致突變作用，能對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生較強(qiáng)的遺傳損傷，且損傷程度隨阿特拉津染毒質(zhì)量濃度的增加或污染脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

[1]Hincapie M,Maldonado MI,Ol ler I,et al.Solar photocataly ticde gradation and detoxi f ication of EU priority substances[J].Catalysis Today,2005,101:203-210.

[2]Freeman JL, Rayburn LA. Developmental impact ofat razine onmetamorphig Xenopus Laevis as revealed by nuclear analysis andmorphology [J].Environ Toxicol Chem,2004,(24)7:1648-1653.

[3]Prasad TAV,Ti lapia DC.Atrazine toxicity on hydromineral balance of f ish,Ti lapia mossambius[J]. EcotoxicolEnviron Saf ty, 1994, 28: 313-316.

[4]金煥榮，段志文，張?jiān)?，?阿特拉津的遺傳毒性研究[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，1999，25（6）：341-343.

[5]Hayes TB,Col lins A,LeeM,et al.Hermaphroditic, demascul inized f rogs af ter exposure to the herbicide,at razine,at low ecological ly relevant doses[J].Proc Nat.l Acad Sci USA,2002,99:5476-5480.

[6]劉營(yíng)，孔繁翔，楊積晴.生物降解阿特拉津的研究進(jìn)展[J].上海環(huán)境科學(xué)，2000，15（7）：41-45.

[7]Mandelbaum RT,Al lan DL,Wacket t LP.Isolation and characterization of a pesudomonas sp: thatm ineral izes the s-t riazine herbicide at razine[J]. Appl Environ Microbio, 1995,161(4):1451-1457.

[8]Fernandez ML,Haridon J,Gauthier L． Amphibian micronucleus test(s):a simple and rel iable method for evaluating in vivo genotoxic ef fects of f reshwater pol lutants and radiations． Initial assessment[J]. Mutat Res, 1993,292(1):83-99.

[9]Zavala-Aguirre JL,Torres-Bugarin O,Zamora-Perez AL． Aquatic ecotoxicology approaches in Western Mexico[J]． J Environ Sci Heal th A: Tox Hazard Subst Environ Eng, 2007, 42 (10):1503-1511.

[10]朱毅，胡小玲.重金屬對(duì)魚(yú)類毒性效應(yīng)研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，1998，11：22-23.

[11]薛開(kāi)先，季國(guó)芳，孫玉潔，等.微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，1986，13（5）：397-402.

[12]錢(qián)曉薇.乙酸銅對(duì)黃鱔紅細(xì)胞微核及核異常的影響[J].江西科學(xué)，2004，22（5）：331-333.

[13]孟順龍，胡庚東，瞿建宏，等.鯽魚(yú)對(duì)除草劑阿特拉津的生物富集效應(yīng)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（6）：1313-1818.

Effectof Atrazine on Micronucleiand Nuclear Anomalies in PeripheralBlood Erythrocytes of Danio rerio

Yu Xingdong,Wei Hua*
(Animal Science and Veterinary Medical Col lege,Shenyang Agricul tural University,Liaoning Shenyang 110866)

In this study,the toxic ef fects of at razine were investigated by detecting micronuclei and nuclear anomalies in peripheral red blood cel ls of Danio rerio.Four at razine levels（0、0.5、5.0 and 10.0 mg/L）were chosen for gradient.The peripheral red blood cel ls of Danio rerio were sampled on 1、3、6 and 9 days respectively.The resul ts showed that there were more micronuclei and some kinds of nuclear anomal ies af ter exposure to four levels of at razine than that of the cont rol groups,including micronucleus,nucleus endo-vacuole,enucleated cel l,karyopyknosis and unequal nuclear division.The resul ts showed that atrazine had a potential genetic toxicity on Danio rerio.In general，the genotoxic ef fects of at razine increased with the increasing level of exposure concent rations or dutaion under certain exposure conditions.

Atrazine;Danio rerio;Erythrocyte;Micronucleus;Nuclear abnormal ies

X592

1672-9692(2015)07-0015-06

2015-05-20

余興東（1989-），男，本科，專業(yè)為水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。

魏華（1980-），女，講師，博士在讀，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)教師科研基金（20131012）