楊書堯，劉 莉，馬躍超，陳 寧，謝希賢

(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

利巴韋林，化學(xué)名1–β–D–呋喃核糖基–1,H–1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰，又名病毒唑，是一種高效廣譜的核苷類抗病毒藥物，對(duì)多種DNA 和RNA 病毒均有較好的抑制作用[1].利巴韋林的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法.目前化學(xué)合成法是合成利巴韋林的主要生產(chǎn)方法，但是化學(xué)合成法步驟繁瑣、條件苛刻.酶催化法主要是利用嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化底物核苷或D–核糖–1–磷酸酯與1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰(TCA)反應(yīng)，直接合成利巴韋林[2].雖然酶催化法可以簡(jiǎn)化反應(yīng)步驟、條件簡(jiǎn)單，但誘導(dǎo)劑的添加提高了生產(chǎn)成本且不利于后續(xù)的分離純化.發(fā)酵法合成利巴韋林原料簡(jiǎn)單、污染小，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力.古屋晃等[3]利用產(chǎn)核苷的枯草芽孢桿菌屬和短桿菌屬的微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)積累利巴韋林，但利巴韋林產(chǎn)量小于1,g/L.武改紅等[4]以鳥苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌TM903 為供試菌，在5,L 發(fā)酵罐發(fā)酵60,h 積累利巴韋林5.86,g/L.謝希賢等[5]利用枯草芽孢桿菌 TM903 和谷氨酸棒桿菌TL1105 進(jìn)行發(fā)酵罐混菌發(fā)酵，采用變溫控制模式和分階段供氧控制模式發(fā)酵60,h，利巴韋林產(chǎn)量達(dá)到5.96,g/L.

PNP 是嘌呤核苷補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶之一，該酶的主要功能是催化核苷分解為核糖–1–磷酸和相應(yīng)的嘌呤堿基.在體外反應(yīng)時(shí)，若加入另外一種嘌呤堿基或其類似物，可以合成新的嘌呤核苷或其類似物，現(xiàn)已廣泛用于酶催化法生產(chǎn)核苷類抗病毒藥物[6].Bzowska 等[7]根據(jù)PNP 底物專一性和相對(duì)分子質(zhì)量大小的不同將PNP 分為低相對(duì)分子質(zhì)量同源三聚體類和高相對(duì)分子質(zhì)量同源六聚體類.某些微生物會(huì)同時(shí)存在兩種聚體的PNP，如枯草芽孢桿菌.

影響發(fā)酵法合成利巴韋林的主要因素是前體物核苷和PNP.理論上嘌呤核苷和嘧啶核苷都可作為利巴韋林的合成前體，但綜考慮生產(chǎn)成本與PNP 的催化效率，嘌呤核苷更合適.研究表明，肌苷是PNP的最適底物[8].本文以肌苷生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌B.,subtilis Q60 為出發(fā)菌，通過(guò)基因工程技術(shù)提高PNP 的表達(dá)量，比較了兩種PNP 的催化效率.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

肌苷生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌(B.,subtilis)Q60、枯草芽孢桿菌(B.,subtilis)168、大腸桿菌(E.,coli)DH5α和質(zhì)粒pBE43(大腸桿菌–枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，含有P43 啟動(dòng)子)、pBSA43(大腸桿菌–枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，含有 P43 啟動(dòng)子和 sacB 基因信號(hào)肽)、pWB980 (枯草芽孢桿菌質(zhì)粒，含有P43 啟動(dòng)子和sacB 信號(hào)肽)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏.

活化斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，瓊脂20，pH 7.0～7.2.

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母浸膏15，玉米漿12，NaCl 2.5，尿素2，pH 7.0～7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖140(單獨(dú)滅菌)，玉米漿16，酵母粉15，(NH4)2SO4,22，MgSO4·7H2O,5，KH2PO4,5，CaCO320，pH 7.0～7.2.

1.1.2 試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶 Kpn Ⅰ、Sal Ⅰ和 Xho Ⅰ，F(xiàn)ermentas 公司；Solution Ⅰ、Taq DNA 聚合酶、1,kbp DNA Ladder，大連寶生物工程有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，天津?yàn)榭粕镉邢薰?；TCA，純度99%，山東陽(yáng)成生物科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

PCR 儀，Bio-Rad 公司；SBA–40C 型生物傳感儀，山東生物科學(xué)研究所.DNA 序列分析比較采用DNAMAN 2.0 軟件，引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5軟件，電泳圖分析采用Image master Total Lab v1.00軟件.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 過(guò)表達(dá)PNP 質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)B.,subtilis 168 的deoD 的基因序列(Gene ID：940038)和pupG 的基因序列(Gene ID：938731)設(shè)計(jì)引物，見表1.PCR 反應(yīng)體系：首先94,℃預(yù)變性3,min，然后95,℃變性30,s，58,℃退火30,s，72,℃延伸60,s，進(jìn)行30 輪循環(huán)擴(kuò)增，最后一個(gè)循環(huán)完成后，72,℃繼續(xù)延伸10,min.質(zhì)粒構(gòu)建流程：(1)使用引物deoDin-S 和deoD-A 擴(kuò)增deoD 基因片段，Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后連接到載體pBE43，構(gòu)建deoD 胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pBEdeoD.(2)使用引物pupGin-S 和pupGA 擴(kuò)增pupG 片段，Kpn Ⅰ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBE43，構(gòu)建pupG 胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pBEpupG.(3)以質(zhì)粒pWB980 為模板，引物sacB-S 和sacB-A 擴(kuò)增sacB 信號(hào)肽序列(144,bp)；引物deoD-S 和deoD-A擴(kuò)增deoD 基因，通過(guò)重疊PCR 將sacB 信號(hào)肽與deoD 連接，KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBE43，構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒pBSAdeoD.(4)pupG-S和pupG-A 擴(kuò)增pupG 片段，XhoⅠ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBSA43，構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒pBSApupG.所有連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，并送華大基因公司測(cè)序.

1.2.2 過(guò)表達(dá)PNP 重組菌的構(gòu)建

將4 個(gè)重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入肌苷生產(chǎn)菌B.,subtilis Q60[12]，37,℃培養(yǎng)，次日挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，正確的分別命名為過(guò)表達(dá)PNP 菌株Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG；分泌過(guò)表達(dá)PNP 菌株Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG.

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers in this study

1.2.3 重組菌發(fā)酵生產(chǎn)利巴韋林

將4 個(gè)重組菌株和只含有空質(zhì)粒pBE43 的對(duì)照菌株進(jìn)行500,mL 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn).

活化培養(yǎng)：取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，32,℃培養(yǎng)12～14,h，轉(zhuǎn)接后重復(fù)1 次.

種子培養(yǎng)：從新鮮活化斜面上挑取兩環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基中，500,mL 三角瓶裝液量為 30,mL，10,μg/mL 卡納霉素抗性，32,℃、200,r/min 振蕩培養(yǎng)8～10,h 至A600＝8～10.

發(fā)酵培養(yǎng)：10%接種量，36,℃、200,r/min 振蕩培養(yǎng)96,h.從發(fā)酵12,h 開始每隔12,h 添加0.2,g TCA，共添加3 次.

1.2.4 分析方法

發(fā)酵過(guò)程中每12,h 測(cè)定波長(zhǎng)600,nm 下的吸光度.采用SBA–40C 型生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)牵簩l(fā)酵液離心，取上清液，用去離子水稀釋100倍后，取25,μL 稀釋液進(jìn)樣直接讀數(shù).采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中的利巴韋林和肌苷含量：色譜柱為Kromasil C18 柱(250,mm×416,mm，5,μm).利巴韋林測(cè)定條件：發(fā)酵液用離子水稀釋100 倍，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)＝4∶96 的乙腈水溶液，流量1.0,mL/min，柱溫18.5,℃，檢測(cè)波長(zhǎng)207,nm.肌苷測(cè)定條件：發(fā)酵液用1,mol/L NaOH 溶液稀釋10 倍，沸水浴5,min 后離心取上清液，上清液用去離子水稀釋100 倍，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)＝10∶90 的乙腈水溶液，流量 1.0,mL/min，柱溫 25,℃，檢測(cè)波長(zhǎng)248,nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建及鑒定

胞內(nèi)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBEdeoD、pBEpupG 和分泌過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBSAdeoD、pBSApupG 的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1 所示.圖1(a)中，pBEdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在800,bp 左右出現(xiàn)目的條帶.pBEpupG 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在830,bp 左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符.圖1(b)中，pBSAdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在870,bp 左右出現(xiàn)目的條帶，符合sacB 信號(hào)肽序列和 deoD 重疊后的片段大小.pBSApupG 用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切后在830,bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期相符.重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果與GenBank 上報(bào)道的基因序列一致.

圖1 pBEdeoD、pBEpupG、pBSAdeoD 和pBSApupG 的驗(yàn)證Fig.1 Identification of the recombined plasmids pBEdeoD，pBEpupG，pBSAdeoD and pBSApupG

2.2 重組菌發(fā)酵合成利巴韋林

為了研究?jī)煞N結(jié)構(gòu)的PNP 在肌苷生產(chǎn)菌中過(guò)表達(dá)以及不同的表達(dá)方式對(duì)合成利巴韋林的影響，將4株重組菌株和只含有pBE43 空質(zhì)粒的對(duì)照菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定期取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)吸光度、肌苷和利巴韋林的產(chǎn)量，發(fā)酵過(guò)程曲線如圖2 所示.

圖2 利巴韋林搖瓶發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.2 Fermentation parameters of ribavirin

結(jié)果顯示：4 株重組菌的菌體干質(zhì)量都小于對(duì)照菌，胞外分泌過(guò)表達(dá)重組菌 Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG 減少明顯，而且這兩株菌的對(duì)數(shù)期縮短，20,h 后即進(jìn)入平穩(wěn)期；而胞內(nèi)表達(dá)重組菌Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG 與對(duì)照菌相似，在40,h 左右才進(jìn)入平穩(wěn)期.其原因可能是酶的過(guò)表達(dá)給菌體的生長(zhǎng)造成了不同程度的負(fù)擔(dān).對(duì)照菌從10,h 開始積累肌苷，產(chǎn)量平穩(wěn)上升，發(fā)酵80,h 后趨于平緩.對(duì)照菌在添加TCA 后開始有少量的利巴韋林積累，但是積累量保持在2,g/L，不隨著肌苷的增長(zhǎng)而上升.4 株重組菌株的肌苷含量與對(duì)照菌相比則明顯減少，添加TCA 后，利巴韋林合成量明顯增長(zhǎng)，PNP816重組菌Q60/pBEpupG 和Q60/pBSApupG 的增長(zhǎng)程度較大.PNP702重組菌 Q60/pBEdeoD 和Q60/pBSAdeoD 的利巴韋林合成趨勢(shì)雖然與前者一致，但是合成量低20%左右.另外，相同的PNP 采用分泌過(guò)表達(dá)利巴韋林合成量比胞內(nèi)過(guò)表達(dá)高.

4 株重組菌的利巴韋林產(chǎn)量是對(duì)照菌的4～6倍；肌苷剩余量?jī)H為對(duì)照菌的15%～30%，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PNP 可以提高利巴韋林的合成效率.重組菌的利巴韋林產(chǎn)量、肌苷轉(zhuǎn)化率和TCA 利用率見表2.

表2 重組菌的核苷總產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率比較Tab.2 Comparison of the yields of total nucleoside and inosine utilization of the recombined strains

由表2 可以看出重組菌Q60/pBEpupG 的利巴韋林產(chǎn)量比Q60/pBEdeoD 高32.5%；Q60/pBSApupG的利巴韋林產(chǎn)量比Q60/pBSAdeoD 高39.6%，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PNP816更有利于利巴韋林的合成.胞外分泌型過(guò)表達(dá)重組菌Q60/pBSAdeoD 的產(chǎn)量比Q60/ pBEdeoD 高9.6%；Q60/pBSApupG 比Q60/pBEpupG 高15.5%，4 株重組菌的TCA 利用率也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，與對(duì)照菌相比，分別提高了3.2～5.5 倍，說(shuō)明PNP 的分泌表達(dá)有利于利巴韋林的合成.

3 討論

發(fā)酵法合成利巴韋林需要核苷作為前體物，PNP作為催化劑.研究表明3 種嘌呤核苷中肌苷是最適底物，所以本研究以肌苷生產(chǎn)菌作為出發(fā)菌，構(gòu)建4株不同類型的PNP 過(guò)表達(dá)菌株，通過(guò)外源添加TCA的方法將利巴韋林的合成和肌苷的發(fā)酵相偶聯(lián)，隨著菌體生長(zhǎng)、前體物肌苷的積累和酶的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)一步法合成利巴韋林.

發(fā)酵結(jié)果顯示，在肌苷生產(chǎn)菌中過(guò)表達(dá)PNP816利巴韋林的合成效率和底物TCA 的利用率都高于PNP702，這與已發(fā)表的研究結(jié)果一致.Xie 等[9]發(fā)現(xiàn)當(dāng)以肌苷作為反應(yīng)底物時(shí)，PNP702和PNP816的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值分別為(1.23±0.01),μmol/L 和(0.31±0.01),μmol/L，PNP816具有更強(qiáng)的親和力，所以利巴韋林產(chǎn)量更高.另外三聚體酶蛋白每形成1 個(gè)具有催化活性的酶分子需要3 條肽鏈；而六聚體酶蛋白每形成1 個(gè)具有催化活性的酶分子需要6 條肽鏈，當(dāng)利用同樣的表達(dá)質(zhì)粒，在同樣的發(fā)酵條件下，相同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄量相近，三聚體形成具有催化活性的酶分子所需要的能量少于六聚體，效率更高[10].

利巴韋林的合成過(guò)程中外源添加的底物TCA 存在于發(fā)酵液中，將PNP 分泌到胞外可能會(huì)提高反應(yīng)效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示分泌過(guò)表達(dá)重組菌的利巴韋林產(chǎn)量和TCA 的利用率都高于胞內(nèi)表達(dá)的重組菌，但是肌苷的利用率并沒(méi)有胞內(nèi)表達(dá)高.利巴韋林是核苷類似物，含有1 分子5–磷酸核糖，從兩種核苷類產(chǎn)物的總量上看，分泌表達(dá)比胞內(nèi)表達(dá)積累的核苷總量更高，可能原因是底物肌苷直接與TCA 在胞外進(jìn)行反應(yīng)，減少了TCA 跨膜輸入和利巴韋林跨膜輸出的消耗，菌株的負(fù)擔(dān)更小.轉(zhuǎn)化率低的可能性是酶的表達(dá)方式不同，導(dǎo)致酶量和活性方面存在差異；另外，胞內(nèi)和胞外的催化環(huán)境不同，酶的催化活性也可能受到了影響[11].

研究表明[12]：當(dāng)催化以肌苷為底物反應(yīng)時(shí)的催化活性設(shè)定為酶活標(biāo)準(zhǔn)(100%)時(shí)，PNP702催化鳥苷的活性為46.2%；PNP816催化鳥苷的活性為87.7%；等質(zhì)量的純化重組PNP 在磷酸鹽緩沖液中以鳥苷為核糖基供體時(shí)兩種酶的利巴韋林終產(chǎn)率均略高于肌苷.理論上鳥苷的分解產(chǎn)物鳥嘌呤較肌苷的分解產(chǎn)物次黃嘌呤溶解性低，有利于反應(yīng)向利巴韋林合成方向進(jìn)行[13]；但是目前還未見通過(guò)改造鳥苷生產(chǎn)菌提高PNP 活性來(lái)研究利巴韋林合成的相關(guān)報(bào)道.因此，今后的研究方向可以考慮以鳥苷作為核苷前體物，對(duì)鳥苷高產(chǎn)菌進(jìn)行改造，提高其PNP 的酶活性，研究對(duì)利巴韋林合成的影響.

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