朱迎春 ，張坤生，霍乃蕊，馬儷珍

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；4.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

從海洋哺乳動物鯨類和海洋魚類以及淡水魚所獲得的油脂，統(tǒng)稱為“魚油”，以區(qū)別來自陸地動、植物和其他海洋動、植物的油脂.魚油富含不飽和脂肪酸EPA、DHA 等組分，對人體健康有益且具有特殊價值.隨著人們對魚油食用價值研究的不斷深入，魚油的開發(fā)利用愈發(fā)受到人們的重視[1–2].

魚油的提取方法有蒸煮法、淡堿水解法、水法和超臨界流體萃取法等[3].蒸煮法使用較廣，所涉及的實驗參數(shù)較少，Aidos 等[4]對該法進行優(yōu)化，生產(chǎn)出較好質(zhì)量和較高產(chǎn)量的魚油.淡堿水解法是我國魚油生產(chǎn)普遍采用的一種方法，所用淡堿為氫氧化鈉稀溶液，鹽為氯化鈉溶液，工藝已非常成熟.該方法與蒸煮法相比具有出油率和維生素得率高，產(chǎn)品色澤淺、游離脂肪酸含量少的優(yōu)點，但提油后的殘渣得不到有效利用，形成了新的廢棄物[5].陳英鄉(xiāng)[6]提出水法提取魚油的工藝，向原料中加入一定量的水，通過加熱使蛋白質(zhì)變性，破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合關(guān)系，經(jīng)高速離心得到魚油.超臨界萃取法是近些年來發(fā)展起來的新工藝，較適合于粗魚油加工后期生理活性物質(zhì)EPA 和DHA 的分離提純，但是投入規(guī)模較大、所需資金較多[3].

本實驗作為“淡水魚魚糜安全及品質(zhì)控制和副產(chǎn)物高值化利用關(guān)鍵技術(shù)研究與工程示范”課題的一部分，不僅要得到魚油，還要使脫油后的殘渣適合酶解處理.蒸煮法、淡堿水解和水法會使蛋白變性，使其不能進行酶解，故用多種有機溶劑提取魚油，篩選得率較高的方法，獲得感官質(zhì)量和貯藏性能較好的魚油，并使脫油后的殘渣能進一步利用，以提高原料的綜合利用率.

1 材料與方法

1.1 原料預(yù)處理與試劑

將市售鯰魚(革胡子鯰)加工過程中廢棄的碎肉、魚皮、魚骨、內(nèi)臟分開絞碎，冷卻貯藏備用.

正己烷、異丙醇、乙醚、石油醚、正丁醇、丙酮等均為分析純.VE，1,000,IU/g，北京索萊寶科技有限公司.

1.2 儀器設(shè)備

TDL–5 型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF–6051 型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RE–52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FP62型熔點儀，瑞士梅特勒公司；7890A 型氣相色譜儀，美國Agilent 公司.

1.3 不同有機溶劑提取魚油

分別采用不同有機溶劑在低于其沸點的條件下浸提5,h，丙酮、正丁醇、正己烷、丙酮–石油醚(V(丙酮)∶V(石油醚)＝1∶4)的浸提溫度分別為40、100、50、40,℃.方法如下：稱取1.00,g 鯰魚碎肉于100,mL碘量瓶中，按料液比1∶18 加入提取劑，振搖提取20,min，過濾，并用少量提取劑洗滌碘量瓶及殘渣2～3 次.濾液轉(zhuǎn)入已烘干至恒質(zhì)量的接收瓶中，除去有機溶劑后轉(zhuǎn)入100,℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，分別測定魚油的提取率.根據(jù)提取率及魚油的感官質(zhì)量考察提取效果.

除以上4 種方法外，還利用正己烷–異丙醇法來提取魚油：準(zhǔn)確稱取鯰魚碎肉1,g 于100,mL 碘量瓶中，按料液比1∶18 加入正己烷–異丙醇(V(正己烷)∶V(異丙醇)＝3 ∶2)，50,℃充分水浴振搖20,min.用砂芯漏斗抽濾，并用2,mL 提取劑分3 次洗碘量瓶及殘渣.濾液轉(zhuǎn)入250,mL 分液漏斗中，加入10,mL 10,g/L 的Na2SO4溶液，振搖1,min，靜置分層，下層水相用 2,mL 正己烷–異丙醇(V(正己烷)∶V(異丙醇)＝7∶2)反萃取3 次.合并上層有機相于已稱量的三角瓶中，70,℃水浴揮發(fā)溶劑，再轉(zhuǎn)入100～105,℃烘箱中烘10,min[7].取出后按式(1)計算提取率并進行感官質(zhì)量評定.

1.4 正己烷-異丙醇法最優(yōu)條件的確定

將篩選出的提取方法在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗設(shè)計(表1)，確定最佳提取條件.其中A 因素為萃取時正己烷–異丙醇的體積比，B 因素為提取時間(min)，C 因素為反萃取時正己烷–異丙醇的體積比.

表1 正交實驗因素編碼表Tab.1 Design of the orthogonal experiment

1.5 鯰魚不同部位魚油的提取

利用篩選出的最佳工藝條件，分別以鯰魚碎肉、魚皮、魚骨、內(nèi)臟為原料提取魚油，計算提取率.

1.6 魚油穩(wěn)定性實驗

從鯰魚碎肉提取出的魚油分別添加 50、100,mg/kg 的VE，置于室溫(25,℃)貯藏，同時將不添加VE 的魚油作為對照，分別貯藏在37,℃、室溫(25,℃)及4,℃.貯藏期間測定其酸價、碘價、過氧化值的變化.37,℃貯藏的魚油每天測定1 次指標(biāo)，共測定7次；室溫(25,℃)貯藏的魚油每3,d 測定1 次指標(biāo)，共測定7 次；4,℃貯藏的魚油每7,d 測定1 次指標(biāo)，共測定4 次.酸價、過氧化值、碘價分別參照GB/T 5530—2005《動植物油脂·酸值和酸度測定》、GB/T 5538—2005《動植物油脂·過氧化值測定》、GB/T 5532—2005《動植物油脂·碘值的測定》[8–9]進行測定.

1.7 魚油中脂肪酸組成的測定

精確吸取從鯰魚碎肉提取的魚油樣品0.1,mL 以及1,mL 內(nèi)標(biāo)物(十七烷酸甲酯)，放入10,mL 容量瓶中.再加入2,mL 提取液(V(苯)∶V(石油醚)＝1∶1)，靜置30,min 以上，以浸提油脂，然后加入1,mL 0.4,mol/L 的KOH/CH3OH 溶液，靜置10,min 以上，甲酯化后加超純水至刻度，待上層液澄清后，準(zhǔn)確移取1,μL 進樣，進行色譜分析.

對測定條件(程序升溫、氣體流量、壓力等)反復(fù)摸索，最終確定脂肪酸分離效果最佳的色譜條件為：DB–WAX 型石英毛細(xì)管柱(30,m×0.25,mm)，固定相FFAP；FID 檢測器，檢測器溫度280,℃；進樣口溫度 280,℃，柱溫先 180,℃保持 20,min，然后以0.5,℃/min 的速率將溫度升至200,℃；載氣(N2)流量25,mL/min，H2流量 40,mL/min，空氣流量 450 mL/min；分流比30∶1.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機溶劑的提取效果

不同有機溶劑提取魚油，提取率及魚油的感官質(zhì)量見表2.綜合考慮選用正己烷–異丙醇法提取魚油，雖提取率略低于正己烷，但魚油的感官質(zhì)量最好.

表2 不同提取劑的提取效果Tab.2 Extraction efficacy of fish oil using different organic solvents

2.2 提取條件正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4.A、B、C 3 個因素對魚油的提取率均產(chǎn)生極顯著影響.3因素的影響順序為A＞C＞B，即萃取時正己烷–異丙醇的體積比對提取條件的影響最大，其次為反萃取時正己烷–異丙醇的體積比.

表3 魚油提取條件正交實驗結(jié)果Tab.3 Design and the results of orthogonal experiment for the extraction of fish oil

表4 魚油提取條件的方差分析Tab.4 Variation analysis of fish oil extraction conditions

最理想的提取條件是A2B2C2，但實驗中沒有此組合，故將第5 組提取條件A2B2C3與理想的提取條件A2B2C2進行驗證實驗，結(jié)果在理想的提取條件下提取率相當(dāng)(27.92%)且提取時間較短.因此，最后確定魚油提取條件為：萃取時正己烷–異丙醇的體積比為3∶2，提取時間為20,min，反萃取時正己烷–異丙醇的體積比7∶2.

2.3 鯰魚不同部位的魚油提取率

不同部位魚油的提取率分別為：魚內(nèi)臟(55.69%)＞魚碎肉(27.92%)＞魚皮(10.72%)＞魚骨(6.43%).此結(jié)果一定程度上也反映了魚油在魚體內(nèi)的分布狀況.魚內(nèi)臟中存在大塊魚油，所以提取率最高；由于魚骨較難絞碎，先期進行了高壓處理，此過程會引起部分油脂的損失，這也是其提取率最低的原因之一.

2.4 魚油在不同貯藏條件下酸價、碘價和過氧化值的變化

酸價可反映脂肪酸的分解程度，油脂酸敗將導(dǎo)致游離脂肪酸的增加.油脂在較高溫度下容易發(fā)生水解，在低溫下三酰甘油酯中的酯鍵發(fā)生水解的機率要小一些.不同貯藏條件下魚油酸價的變化如圖1 所示.由圖1 可知：隨貯藏時間的延長，貯藏溫度越高，酸價也越高.在魚油中添加VE，可以抑制酸價的升高，VE 添加量為100,mg/kg 時，酸價最低，與4,℃冷藏條件下的結(jié)果一致.

圖1 不同貯藏條件下魚油酸價的變化Fig.1 Changes of fish oil acid value under different storage conditions

過氧化值是判斷油脂酸敗的重要指標(biāo)，也是判斷油脂氧化及氧化程度的主要指標(biāo).不同儲存條件下魚油過氧化值的變化如圖2 所示.由圖2 可知：隨貯藏時間的延長，37,℃下貯藏的魚油過氧化值上升幅度大于其他實驗組，特別是在貯藏初期增幅尤大，這與他人的實驗結(jié)果[10–11]相一致.降低貯藏溫度或在魚油中添加VE 會使過氧化值降低，在魚油中添加100,mg/kg 的VE 或在4,℃冷藏條件下貯藏時，過氧化值最低，產(chǎn)品氧化穩(wěn)定性較好.

圖2 不同儲存條件下魚油過氧化值的變化Fig.2 Changes of fish oil peroxide value under different storage conditions

碘價可用來判斷脂肪酸的不飽和度.不同儲存條件下魚油碘價的變化如圖3 所示.由圖3 可知：隨貯藏時間的延長，不同貯藏條件下魚油的碘價變化不盡相同.在魚油中添加100,mg/kg VE 室溫儲存與4,℃冷藏條件下儲存效果相當(dāng)，碘價基本維持原有水平，變化不大.而在魚油中添加的VE 量為50,mg/kg時，碘價低于 100,mg/kg VE 添加組和 4,℃儲存組.隨著貯藏溫度的升高，魚油碘價值降低的趨勢比較明顯.由圖1—圖3 可以看出：在37,℃溫度條件下貯存的魚油穩(wěn)定性較差；但是添加100,mg/kg VE 后常溫下貯存或在4,℃冷藏條件下貯藏的魚油穩(wěn)定性均較高.

圖3 不同儲存條件下魚油碘價的變化Fig.3 Changes of fish oil iodine value under different storage conditions

2.5 魚油脂肪酸組成

正己烷-異丙醇法提取的魚油，其脂肪酸各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表5.

表5 魚油脂肪酸組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.5 Content of fatty acid in fish oil

由表5 可知：鯰魚魚油的主要成分為C14～C22脂肪酸，其中飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.34%，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.84%，而多不飽和脂肪酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)22.62%.飽和脂肪酸以棕櫚酸、硬酯酸為主，其中棕櫚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大(21.14%).不飽和脂肪酸以C18∶1、C20∶1、C20∶5、C22∶6為主，其中油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而魚油中多不飽和脂肪酸中含有AA(花生四烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.38%、0.66%和0.26%，其中DHA 和AA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于草魚腹部和內(nèi)臟中魚油的DHA 和AA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14].

3 討論

3.1 正己烷–異丙醇法的優(yōu)點

我國的魚油廠普遍采用淡堿水解法生產(chǎn)魚油[5]，在此基礎(chǔ)上相繼又產(chǎn)生了鉀法及氨法，這些方法會使脫油后的原料變性而不能進一步利用.所以，本實驗采用有機溶劑進行魚油的提取.該法提取的魚油提取率較高且感官質(zhì)量較好，且脫油后的原料能進一步進行酶解處理制備鯰魚多肽，從而可提高原料的附加值.在對有機溶劑進行篩選的過程中，長期以來，氯仿–甲醇法一直被用作從各類樣品中提取脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法，尤其適用于磷脂含量較高的油脂的提取，由于氯仿、甲醇都具有較強的毒性，存在安全隱患，所以本實驗選用了毒性較低的正己烷和異丙醇作為提取試劑.為了進一步解決溶劑殘留的問題，在生產(chǎn)中還應(yīng)與酶提取法、超臨界CO2萃取法等多種技術(shù)相結(jié)合，有效降低有機溶劑殘留量.

對使用過的提取劑通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行回收，實驗結(jié)果表明回收率為63.33%，用回收的提取劑對魚油進行提取，提取率為13.20%，雖然有所降低(一次提取率為27.92%)，但仍可節(jié)省提取劑的用量，降低提取成本.

3.2 鯰魚魚油的營養(yǎng)價值

大多數(shù)動物油脂不飽和脂肪酸含量較低，熔點較高，消化吸收率低，故營養(yǎng)價值較低.本研究提取的鯰魚魚油含有亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、EPA 和DHA 等有益于人體健康的脂肪酸，營養(yǎng)價值頗高.計算可知，總脂肪、必需脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 94.18%、19.96%、28.34%和 65.84%.其中，α–亞麻酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51%，高于植物杏仁油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.13%)[15]，亞麻酸可以在體內(nèi)衍生出視網(wǎng)膜受體中最豐富的脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，為維持視紫紅質(zhì)正常功能所必需.經(jīng)測定鯰魚魚油的熔點為15,℃，較低的熔點可以提高魚油的消化吸收率，提升它的營養(yǎng)價值.

3.3 鯰魚魚油的穩(wěn)定性

魚油易氧化的原因主要是因為魚油中含有不飽和脂肪酸.整個儲存期間，在不同的儲存條件下，魚油的碘價下降，酸價、過氧化值升高，說明其穩(wěn)定性下降.添加一定劑量的VE，可有效抑制油脂的氧化，當(dāng)添加劑量為100,mg/kg 時，其儲存效果與冷藏效果相當(dāng).在下一步的研究中，擬將低溫貯藏和添加VE相結(jié)合，預(yù)計會有更好的效果.我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，作為食品添加劑，VE 在動物脂肪中的添加量為0.001%～0.05%[16]，本研究VE 的添加量在國家要求的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，所以不存在安全問題.

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