姚貴陽房麗晶潘正銀王恒山粟 武

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 桂林 541000)

化學(xué)修飾的環(huán)孢菌素類非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑進(jìn)展

姚貴陽1房麗晶1潘正銀1王恒山2粟 武1

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 桂林 541000)

親環(huán)素(Cyps)是一類在自然界分布廣泛、具有高度保守性的多功能蛋白家族，也是重要的免疫抑制藥物環(huán)孢菌素 A(CsA)的蛋白受體，具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性。非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑是基于CsA 骨架而改造得到的衍生物，這些衍生物能夠在抑制親環(huán)素活性的同時降低免疫抑制活性。一些非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑(Alisporivir、SCY-635 和 NIM811)已經(jīng)證明對丙型肝炎傳染病治療有臨床療效。最近的研究發(fā)現(xiàn)親環(huán)素蛋白抑制劑還具有治療多種病毒性感染，炎性癥狀，以及癌癥的潛力。文章綜述了非免疫抑制性環(huán)孢菌素衍生物在臨床和臨床前開發(fā)的構(gòu)效關(guān)系，并討論了這些候選藥物的藥代動力學(xué)和化學(xué)生物學(xué)特性。

親環(huán)素；環(huán)孢菌素 A；非免疫抑制；抗病毒；構(gòu)效關(guān)系

1 引 言

環(huán)孢菌素 A 是由真菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然環(huán)肽，具有抑制親環(huán)素一類肽基脯氨酰異構(gòu)酶的活性且一般都有免疫抑制活性[1-3]。對環(huán)孢菌素及其類似物的合成和結(jié)構(gòu)修飾衍生出了一些低免疫抑制性但保留抑制親環(huán)素能力的分子[4]?！胺敲庖咭种菩杂H環(huán)素抑制劑”概念的提出已經(jīng)為闡明環(huán)孢菌素的作用機(jī)制和生物特性提供了重要的依據(jù)。此外，非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑 Alisporivir、SCY-635 和 NIM811 已經(jīng)在臨床上用于治療丙型肝炎[5]。更值得我們關(guān)注的是，很多研究認(rèn)為這些非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑可能對廣泛的疾病都有藥效。2010－2013 年的報道就明確指出親環(huán)素抑制劑可以用于治療多種病毒感染、炎性癥狀、心力衰竭和癌癥等疾病[6-9]。

Ito 等[10]在其 2013 年的綜述中指出，有一些具有生物活性的環(huán)肽又重新應(yīng)用在醫(yī)藥活性劑上，所以環(huán)孢菌素類似物的獨特藥性和藥物特性也得到了重新重視。比如，這些天然類似物清晰的構(gòu)效關(guān)系能夠充分說明蛋白與配體親和力的關(guān)系[11]，體外親環(huán)素親和力實驗和這些分子在細(xì)胞水平的活性研究也提供了尋找提高環(huán)肽細(xì)胞通透性的方法[12,13]。在本文中，我們討論了非免疫抑制性環(huán)孢菌素的發(fā)現(xiàn)及其藥代動力學(xué)，重點討論了非免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物的構(gòu)效關(guān)系。

2 環(huán)孢菌素及親環(huán)素的發(fā)現(xiàn)

環(huán)孢菌素 A(圖 1，CsA)最初是由山德士公司在篩選無細(xì)胞毒性免疫抑制劑的項目中發(fā)現(xiàn)[14,15]。它的開發(fā)徹底改變了器官移植的治療水平，此外，越來越多研究發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素也可以應(yīng)用于銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和葡萄膜炎的治療。深入的機(jī)理研究逐漸發(fā)現(xiàn)很多環(huán)孢菌素免疫抑制作用可以歸因于它與細(xì)胞親環(huán)素蛋白(Cyps)和鈣調(diào)磷酸酶(CaN)的兩個亞基形成的三元復(fù)合物(圖 2)[15-17]。因為形成的三元復(fù)合物可以保護(hù)活化 T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，所以可以阻滯與免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白表達(dá)[18,19]。

圖 1 環(huán)孢菌素 A(左，化合物 1)及其骨架結(jié)構(gòu)(右)[15]Fig. 1 Cyclosporin A(left) and its solid state structure(right)[15]

圖 2 環(huán)孢菌素 A 與親環(huán)素(左)和鈣調(diào)蛋白(右)的作用示意圖(1MF8 和 1CWA))[15]Fig. 2 Left: Complex between cyclophilin A, cyclosporin A, and calcineurin (PDB code 1MF8) Right: Structure of cyclosporin A bound in cyclophilin A conformation (PDB code 1CWA)[15]

2.1 親環(huán)素的發(fā)現(xiàn)

親環(huán)素蛋白的發(fā)現(xiàn)是基于對天然產(chǎn)物環(huán)孢菌素家族的研究。第一個親環(huán)素是由科學(xué)家 Fischer等[20]于十九世紀(jì)八十年代從豬腎皮質(zhì)中純化得到的，在被發(fā)現(xiàn) 4 年之后，這個蛋白質(zhì)被證實與哺乳動物的胸腺細(xì)胞[21,22]和人類 T 細(xì)胞[23,24]中與環(huán)孢菌素 A 結(jié)合的蛋白是相同的。目前，Cyps 已經(jīng)被證明存在于大腸桿菌到智人的各種門類中。比如，酵母的厭氧菌的纖維小體有 8 種親環(huán)素，果蠅有 14 種親環(huán)素，人類細(xì)胞至少有 20 種親環(huán)素[25]。其種類目前研究可以分為兩大類共 20 種(圖 3)[15]。親環(huán)素的原型親環(huán)素 A 幾乎是僅有催化結(jié)構(gòu)的低分子量蛋白，其他旁系增加了其他區(qū)域可以將分子量提升到 354 kDa，這些區(qū)域通過調(diào)節(jié)蛋白與蛋白的相互作用和細(xì)胞內(nèi)的位置，從而控制這些蛋白質(zhì)參與許多生物過程[26]。

親環(huán)素是肽基順反異構(gòu)酶的一個子集(圖3)。這些酶催化順式和反式脯氨酸的結(jié)構(gòu)互換(圖 4)。雖然反式的氨基酸亞氨基的肽鍵更穩(wěn)定，但在含脯氨酸(Pro)殘基的蛋白質(zhì)分子中，30% 的肽鍵是順式構(gòu)象。這表明大多數(shù)含 Pro 殘基的蛋白相互作用需要脯氨酰異構(gòu)酶。然而，從目前的研究來看，科學(xué)家們還不清楚是否所有的生物功能都能被 Cyps 調(diào)控。據(jù)我們所知自噬蛋白的作用就不需要肽基順反異構(gòu)酶活性，因為實驗過程中并沒有檢測到自噬功能涉及的幾個肽基脯氨酰順-反異構(gòu)酶(PPIL2，PPIL4，PPIL6 和SDCCAG-10)的表達(dá)。當(dāng) CsA 和 Cyps 結(jié)合后，環(huán)孢菌素分子結(jié)構(gòu)與游離的 CsA 分子結(jié)構(gòu)相比構(gòu)象發(fā)生了顯著的變化[27]，分子中原有的氫鍵全部斷裂，新的氫鍵形成。除此之外，分子中的酰胺鍵由順式轉(zhuǎn)化為反式，這樣形成的復(fù)合物才能與 CaN 結(jié)合；而單獨的 CsA 或 CyP 則都不能與 CaN 結(jié)合。另外，據(jù)報道環(huán)孢菌素及其類似物與 Cyps 結(jié)合能力的強(qiáng)弱并不能體現(xiàn)為免疫抑制的強(qiáng)弱。

圖 3 親環(huán)素蛋白的分類示意圖Fig. 3 The class of Cyclophilin protein

圖 4 親環(huán)素催化脯氨酸旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化示意圖Fig. 4 Interconversion of proline rotamers catalyzed by the cyclophilins

2.2 環(huán)孢菌素的發(fā)現(xiàn)

環(huán)孢菌素 A(圖 1)是一種分子量約 1200 Da的環(huán)狀十一肽。各種光譜和結(jié)構(gòu)的研究表明，CsA 及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)是非常柔性的。環(huán)孢菌素類衍生物與親環(huán)素蛋白的親和力跟環(huán)孢菌素與親環(huán)蛋白結(jié)合能密切相關(guān)[28-30]。柔性結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為是 CsA 具有顯著的細(xì)胞通透性和較高的生物利用度的原因[31]。在非極性溶劑和固體(游離的)狀態(tài)下，CsA 所有的酰胺氫會參與分子內(nèi)氫鍵或與酰胺羰基形成氫鍵作用(圖 1，右)。在這種氫鍵作用下，結(jié)構(gòu)中疏水性側(cè)鏈和 N-烷基團(tuán)形成了極性的大環(huán)酰胺鍵疏水層。據(jù)推測，環(huán)孢菌素A 就是利用這種結(jié)構(gòu)通過細(xì)胞膜。CsA 在極性溶劑中結(jié)合親環(huán)素時，親水酰胺基團(tuán)裸露，肽鍵處于反式位置。此外，MeBmt 的羥基殘基與 P4 位甲基化亮氨酸的羰基形成氫鍵以保持這些基團(tuán)的彼此接近從而保持構(gòu)像的穩(wěn)定，這是 CsA 能夠抑制親環(huán)素的主要原因。

盡管改變 CsA 中氨基酸的種類能影響結(jié)合親環(huán)蛋白的活性，但是環(huán)孢菌素 A 結(jié)合親環(huán)素是直接與 P9、P10、P1 和 P2 基團(tuán)(見圖 1 的編號)的氨基酸相關(guān)[32]。環(huán)孢菌素 A 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶之間的親和作用主要與大環(huán)化合物中的 P4、P5 和P6 的氨基酸相關(guān)[33]。當(dāng) P3 位氮甲基甘氨酸用一個有助于環(huán)孢菌素穩(wěn)定構(gòu)造代替時，設(shè)計非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑的一般策略就是修飾 P4-P5-P6位置的氨基酸來減弱與鈣調(diào)磷酸酶的親和力。

親脂化合物環(huán)孢菌素 A 在體內(nèi)廣泛分布在組織間隙中。盡管血漿蛋白結(jié)合率不是固定值，但是結(jié)合率大概為 95%[34]。CsA 和其他親環(huán)素抑制劑的藥代動力學(xué)分析是非常復(fù)雜的[35]。親環(huán)素在血細(xì)胞的高度表達(dá)(特別是在紅細(xì)胞)導(dǎo)致親環(huán)素抑制劑在血液/血漿中的配比是劑量依賴的。因此，環(huán)孢菌素 A 在紅細(xì)胞中相對飽和的濃度才能保證完全抑制親環(huán)素。環(huán)孢菌素 A 的藥理學(xué)因為與內(nèi)源性轉(zhuǎn)運有關(guān)聯(lián)所以更加復(fù)雜。在體外和體內(nèi)，CsA 是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白的強(qiáng)效抑制劑(OATP1B1 和 OATP1B3)[36,37]，也是多藥耐藥蛋白(MDR1、ABCB1 和 P-gp)、膽鹽出口泵的強(qiáng)抑制劑(BSEP)[38]和 MDR2 的抑制劑[39]。通過幾個環(huán)孢菌素類似物的結(jié)構(gòu)可以推斷出該類化合物抑制 MDR1 的構(gòu)效關(guān)系[40]。目前臨床上正在研究一種非免疫抑制性環(huán)孢素抑制劑伐司樸達(dá)(PSC-833)[41]，它的潛在藥物性質(zhì)可以抑制腫瘤病人做化療時產(chǎn)生的副反應(yīng)[42]。Alisporivir(阿拉泊韋，圖 7)[43]是一種與環(huán)孢菌素 A 結(jié)構(gòu)高度相似的疏水型非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑，也有報道發(fā)現(xiàn)其具有抑制 OATP1B1 及 MDR2 活性的效果。這些轉(zhuǎn)運過程一般涉及膽紅素的排泄以及膽紅素和葡糖苷酸的綴合物排泄到膽汁這些問題。臨床研究表明，一些病人服用阿拉泊韋后會得高膽紅素血癥，所以這類途徑的抑制作用可能會引起高膽紅素血癥。Gallay 等[5]在他的研究中提出大的疏水性環(huán)肽往往是 OATP 抑制劑。有趣的是，如下所述，在環(huán)孢菌素骨架添加親水基團(tuán)可能會減弱對某些轉(zhuǎn)運蛋白的抑制效果。

3 非免疫型環(huán)孢菌素

環(huán)孢菌素 A 的發(fā)現(xiàn)及其潛在的生物活性引起了工業(yè)界、學(xué)術(shù)界以及藥物化學(xué)界許多科學(xué)家的極大興趣。在山德士公司，蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院教授迪特·澤巴赫和一個由藥物化學(xué)家組成的團(tuán)隊合作開發(fā)了數(shù)以百計的環(huán)孢菌素類似物的合成方法[44-48]。此外，更多天然存在的環(huán)孢菌素類衍生物的發(fā)現(xiàn)也使環(huán)孢菌素對于抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答的構(gòu)效關(guān)系逐漸明朗[49]。親環(huán)素 A 發(fā)現(xiàn)之后，酶聯(lián)免疫吸附測定法發(fā)展成為一種可以測定環(huán)孢菌素與親環(huán)素結(jié)合力的方法[50]。大多數(shù)研究報道，多數(shù)環(huán)孢菌素衍生物的免疫抑制性活性與其結(jié)合親環(huán)素 A 的親和力有關(guān)。但是有研究報道在P3 位置修飾大基團(tuán)雖然保留了 CsA 衍生物與親環(huán)素的親和力但失去免疫抑制活性性。其中 P3位置修飾的環(huán)孢菌素類似物 2 是第一個確定的非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑的分子(圖 5)[50]。默克公司的科學(xué)家也報道了很多化學(xué)合成的環(huán)孢菌素類似物[51]，大部分化合物的親環(huán)素結(jié)合力與環(huán)孢菌素 A 相當(dāng)，但是比預(yù)期的免疫抑制活性小得多。在他們公布的報告中，化合物 3 就是比較成功的結(jié)構(gòu)改造，改造的方法就是用一個氮甲基丙氨酸取代環(huán)孢菌素 A 的氮甲基亮氨酸。更進(jìn)一步的生物實驗表明，化合物 3 具有環(huán)孢菌素 A 約50% 的親環(huán)素結(jié)合活性，但只有其 0.4% 的免疫抑制活性[52]。更加值得關(guān)注的是，有研究報道稱親環(huán)素 A 與化合物 3 的復(fù)合體對鈣調(diào)磷酸激酶的親和力可以忽略不計。1994 年，由山德士公司出版的詳細(xì)構(gòu)效關(guān)系研究報告就提出了環(huán)孢菌素 A 類似物可以在降低鈣調(diào)磷酸酶的親和力的同時保留與親環(huán)素結(jié)合活性的推論[53]。雖然那時候三元復(fù)合體(親環(huán)素/環(huán)孢菌素 A/鈣調(diào)磷酸酶)的晶體結(jié)構(gòu)還沒有得到，但是利用核磁共振[54]和環(huán)孢菌素 A/親環(huán)素復(fù)合體的構(gòu)造[55]已能夠確認(rèn) P4-P8 位置是遠(yuǎn)離親環(huán)素結(jié)合分界面的。因此，P4基團(tuán)的修飾可以尋找并發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A/親環(huán)素復(fù)合體和鈣調(diào)磷酸酶之間的相互作用的構(gòu)效關(guān)系。Wenger 在其研究中報道了環(huán)孢素菌 P4 位亮氨酸替代成為纈氨酸(化合物 4，圖 6)或者 4'-OH 亮氨酸( 化合物 5，圖 6)的化學(xué)改造方法，免疫法測定這類衍生物發(fā)現(xiàn)這樣修飾可以大幅降低免疫抑制活性并保留或改善與親環(huán)素 A 結(jié)合能力。從這些結(jié)果可以推斷出，鈣調(diào)磷酸酶具有與 P4 位亮氨酸非常緊密結(jié)合的氫鍵作用，而這種假設(shè)已經(jīng)通過共晶實驗被證實。

圖 5 早期非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑(化合物 2 和 3)Fig. 5 Early nonimmunosuppressive cyclophilin inhibitors 2 and 3

3.1 P3 P4 位修飾的環(huán)孢菌素

過去的研究已經(jīng)表明，對 CsA 的 P3 位甘氨酸做適當(dāng)?shù)男揎梉56]或者在 P4 位引入小的疏水性殘基[57]，可以增加環(huán)孢菌素的結(jié)合位點從而增強(qiáng)其與親環(huán)素的結(jié)合力。這些信息一直指引著藥物化學(xué)家去尋找比 CsA 更強(qiáng)親環(huán)素 A 親和力的非免疫抑制性環(huán)孢菌素衍生物。其中很多衍生物具有成為抗 HIV 活性的潛在臨床藥物[58,59]。Lin 的研究就發(fā)現(xiàn)代表性類似物 6(圖 6)和 NIM-811[60](圖7)是 HIV 病毒擴(kuò)增的抑制劑并且基本上沒有免疫抑制活性。有趣的是，在親環(huán)素結(jié)合力實驗測定中，化合物 6 與親環(huán)素的親和力較化合物 7 高 4倍，但是它的抗 HIV 活性偏低。這個結(jié)果證明用極性殘基修飾 CsA 側(cè)鏈的時候一定要慎重，因為這樣修飾可能會影響其細(xì)胞通透性[61]。目前對化合物 P3 位的修飾主要還是利用澤巴赫和山德士的方法，也就是使用過量二異丙胺鋰(6.0～14.0當(dāng)量)活化 CsA 的 P3 位置產(chǎn)生烯醇中間體，然后可以與各種親電基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)(圖 8)。

圖 6 環(huán)孢菌素 P4 位改造的非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑(化合物 4、5 和 6)Fig. 6 P4-modified nonimmunosuppressive cyclophilin inhibitors 4，5 and 6

從這些最初的研究中獲得的先導(dǎo)化合物來看，大多數(shù)衍生物具有比 CsA 更高的結(jié)合親環(huán)素 A 的活性。這些抑制劑已經(jīng)作為丙肝的潛在臨床藥物進(jìn)行研究，除此之外也使用于許多其他疾病的細(xì)胞和動物模型中。其中化合物 NIM-811的發(fā)現(xiàn)似乎早于上述構(gòu)效關(guān)系的詳細(xì)研究中，因為它最初是作為副產(chǎn)物從彎頸霉屬病菌的菌株發(fā)酵產(chǎn)生的環(huán)孢菌素類似物中分離的。菌株的基因操作是大規(guī)模地獲得化合物 NIM-811 的主要原因，其方法是直接分離有氮甲基異亮氨酸的微生物發(fā)酵液?；衔?NIM-811 的抗 HIV 活性是因為它可以和干擾親環(huán)素 A 與 HIV-p24 核心蛋白結(jié)合。隨著發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素 A 在丙肝病毒(Hepatitis C Virus，HCV)復(fù)制中的特異作用，化合物 NIM-811 的發(fā)展被專注于丙肝肝炎的治療上[62,63]。值得我們關(guān)注的是，盡管 HCV 具有高度遺傳變異性，但是化合物 NIM-811 仍然可以有效阻止其耐藥性的快速發(fā)展。這些研究說明非免疫抑制性親環(huán)蛋白抑制劑具有限制高基因屏障的丙肝病毒耐藥性的產(chǎn)生。在臨床一期治療研究中，化合物NIM-811 在 HCV 感染病人中進(jìn)行了抗病毒活性的研究[64]。雖然每日兩次進(jìn)量且劑量高達(dá) 600 毫克，但是在 14 天之后病人沒有明顯抗病毒治療的副反應(yīng)。

化合物 NIM-811 在許多疾病的動物模型中被當(dāng)作親環(huán)素抑制劑使用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疾病的發(fā)生過程與親環(huán)素功能有關(guān)。在四氯化碳處理生成肝纖維化的動物模型中，化合物 7的使用可以降低肝壞死的程度[65]。這種活性歸因于化合物NIM-811 對親環(huán)素 B 和親環(huán)素 F 的抑制活性。這類化合物在小鼠誘導(dǎo)膽汁淤積模型和減少肝損傷的肝切除術(shù)中可以減少膽汁淤積。這種結(jié)果是因為化合物 NIM-811 具有通過抑制肝細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)換孔的形成來抑制線粒體凋亡的能力[66]。其他研究還認(rèn)為化合物 NIM-811 在體外的實驗是可以起到保護(hù)神經(jīng)的作用[67,68]。而在小鼠哮喘模型中，化合物 NIM-811 被發(fā)現(xiàn)具有修復(fù)白細(xì)胞活化的作用。此外抗炎活性的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的環(huán)孢菌素在白細(xì)胞遷移中扮演了絕對重要的角色[69]。

圖 7 化合物 Alisporivir、NIM811、SCY-635 和 NIM258 的結(jié)構(gòu)Fig. 7 Structure of Alisporivir, NIM811, SCY-635 and NIM258

圖 8 P3 烯醇化合物的生成與修飾Fig. 8 P3 enolate generation and modification

Wenger 和他的團(tuán)隊研發(fā)了一種可以使環(huán)孢菌素 A 在 P3 和 P4 兩個位置同時改造的合成方法(圖 9)[70]。該方法首先在堿性環(huán)境下將大環(huán)環(huán)肽從 P3 和 P4 之間開環(huán)，然后通過埃德蒙降解法將 P4 的殘基脫掉。然后在這個新的線性肽末端通過酰胺耦合引入新的想改造的 P3 和 P4。通過巧妙的切割和重排反應(yīng)，原先 P3 位置的甲基化甘氨酸被脫掉。最后，新的 P3-P4 的修飾線性肽在偶聯(lián)劑和較低濃度的條件下進(jìn)行環(huán)化從而得到一系列 CsA 的衍生物。Debiopharm SA 公司和洛桑大學(xué)的科學(xué)家采用這種技術(shù)，細(xì)致研究了這個位置的構(gòu)效關(guān)系，提出一個新的非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑 Debio-025(Alisporivir[71]圖 7)。在山德士公司早期的研究中，化合物 Alisporivir 中 P4位的纈氨酸基團(tuán)和 P3 位 D-丙氨酸殘基可以減弱衍生物與鈣調(diào)磷酸酶的親和力。此外，在 P4 位還做了一個氮乙基的改造，對于包括 CsA 在內(nèi)的一些親環(huán)素抑制劑來講，這個 P4 N-Me 基團(tuán)也是CYP3A4 介導(dǎo)代謝的主要位點[72]。用 N-Et 代替N-Me 可以提高 CsA 衍生物的生物利用度。

圖 9 環(huán)孢菌素在 P3 和 P4 位改造的方法Fig. 9 Method for modification of P3 and P4 of cyclosporins

對環(huán)孢菌素衍生物抗 HCV 活性的研究發(fā)現(xiàn)：Alisporivir 抑制 HCV 的活性大約比 CsA高 5～10 倍[73]；此外，在細(xì)胞水平的抗病毒分析中發(fā)現(xiàn)其比化合物 NIM811 活性還高。化合物 Alisporivir 的抗病毒活性之所以比早期的一代親環(huán)素抑制劑活性高，可能是因為 P3 位的改造可以提高 Alisporivir 與親環(huán)素的結(jié)合力。用 Alisporivir 作用后丙肝病毒的耐藥性發(fā)展緩慢[74]，而且當(dāng)該化合物與直接作用的抗病毒劑結(jié)合使用時，肝臟細(xì)胞會迅速清晰地復(fù)制。Alisporivir 的改造最初是用來研究治療艾滋病毒感染。對感染艾滋病毒的患者進(jìn)行 10 天給藥研究顯示，每日一次給藥都可以降低病人血漿中的HIV-1RNA 濃度。隨后在 HIV-HCV 合并感染患者的研究中，科學(xué)家們加大了劑量并對患者的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果證明在較高劑量下藥物釋放并沒有按照線性方式增加[75]。

環(huán)孢菌素衍生物 SCY-635(圖 7)是一種非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑，目前已經(jīng)進(jìn)入治療 HCV 感染的臨床二期。該化合物最初是由Aventis 公司在研究 HIV 治療的親環(huán)素抑制劑時發(fā)現(xiàn)的[76]。通過 Sebekia benihana 菌株的酶催化作用得到了 P4 位是 4-羥基-N-甲基亮氨酸的 CsA 衍生物。然后選擇性的烷硫化在 P3 位引入巰基化合物。在這個系列衍生物中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)化合物 SCY-635 的 P3 取代基從-SCH3延伸到-SCH2CH2N(CH3)2基團(tuán)時，化合物的抗 HIV活性會增加，同時體外免疫抑制活性會降低[77]?；衔?SCY-635 的臨床前研究發(fā)現(xiàn)該化合物抑制親環(huán)素 A 的活性只是稍微比化合物 CsA高。此外，對其抗 HCV 活性的研究發(fā)現(xiàn)其體外抑制 HCV 復(fù)制是隨時間變化而變化的，但直到給藥 72 小時后才可以完全抑制 HCV 的復(fù)制。相比許多其他親環(huán)素抑制劑來說，化合物SCY-635 似乎具有較弱的抑制轉(zhuǎn)運蛋白活性。盡管在中等濃度(15 μmol/L)下就可以觀察到的 P-糖蛋白外排活性的完全抑制，但在濃度大約是 150 μmol/L 時其抑制 MRP2 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運作用依然十分弱[78]。

Enanta 制藥公司 Owens 等[79]開發(fā)了一個從 CsA 中衍生出的非免疫抑制性親環(huán)素抑制劑EDP-546(其結(jié)構(gòu)沒有報道)。2014 年年初，該公司已經(jīng)啟動了該分子臨床 I 期的研究，雖然化合物 EDP-546 的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)布，但從專利申請發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)應(yīng)該高度類似于 NIM258 的結(jié)構(gòu)(圖 9)。在臨床前藥代動力學(xué)研究中，化合物 10(圖 10)有較低的血液清除率并能高效地分配到肝臟的各個部位。在水性緩沖溶液中，可以觀察到其具有良好的溶解性，特別是在 pH 低于 7 的緩沖液中。另外，化合物 10(圖 10)對膽紅素、藥物轉(zhuǎn)運蛋白 MRP2 和 OATP1B1 的抑制作用比化合物8(圖 10)弱得多[80]。S&T Global 公司 Su 等[81-84]也制備了一系列的 P3 和 P4 改造的 CsA 衍生物，多數(shù)的化合物是以 P4 位 4-OH-Me 亮氨酸環(huán)孢菌素為起點去改造。大部分衍生物在細(xì)胞水平的測定中顯示有抗 HCV 的活性。艾爾健公司也報道了一系列 P3 位置修飾的 CsA 衍生物[85]。結(jié)合安萬特公司和山德士集團(tuán)的最初報告可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CsA 的 P4 位亮氨酸基團(tuán)保留的時候，某些 P3 位替換可能會降低與鈣調(diào)磷酸酶的親和力。

3.2 P1 位改造的環(huán)孢菌素類衍生物

MeBmt 氨基酸對環(huán)孢菌素 A 與親環(huán)素的結(jié)合力的大小是非常重要的，原因在于這個基團(tuán)從親環(huán)素結(jié)合界面延伸到非常接近鈣調(diào)磷酸酶的結(jié)合區(qū)域(圖 2)。較早的研究工作表明，MeBmt位的改造在保留親環(huán)素的結(jié)合活性的同時往往沒有辦法保留 CsA的免疫抑制活性[86]。比較突出的例子就是默克集團(tuán)推出的化合物[CH(OH) CH(CH3)-CH2SCH3]P1-CsA，該衍生物只有 CsA 10% 的免疫抑制活性，但是親環(huán)素結(jié)合活性比CsA 高 78%。在這之后，Aurinia 公司報道一個MeBmt 基團(tuán)增長了碳鏈且 P3 位置原來的甲基化甘氨酸改為 D-N-Me-Ala 的 CsA 衍生物 7(圖 10)[87]。研究發(fā)現(xiàn)，該分子是非免疫型親環(huán)素抑制劑，且抑制親環(huán)素 A 的活性比 CsA 高 13 倍。更加不可思議的是，其免疫抑制活性只有 CsA 的 3%。在2013 年 7 月，Aurinia 公司已經(jīng)在抗丙肝病毒活性的充分評估范圍內(nèi)證實該化合物是一個先導(dǎo)候選藥物。

一般來講，測定環(huán)孢菌素衍生物的免疫抑制活性是在分離的 T 細(xì)胞中。在這種情況下，環(huán)孢菌素的免疫抑制活性主要是與親環(huán)素 A-環(huán)孢菌素復(fù)合體抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性有關(guān)。然而，如上所述，環(huán)孢菌素也會參與其他免疫反應(yīng)過程，比如先天免疫和其他的炎癥。為了探索親環(huán)素抑制劑是否具有通過抑制細(xì)胞外的親環(huán)素抑制白細(xì)胞運輸?shù)臐撃?，德國科學(xué)家 Cordelia Schiene-Fischer 開發(fā)了一系列滲透細(xì)胞膜較差的苯并咪唑類環(huán)孢菌素衍生物[61]。其中，代表化合物 8(圖10)在體外脯氨酸異構(gòu)酶結(jié)合測定中被證實與親環(huán)素 A 結(jié)合力和 CsA一樣，而一個使用熒光標(biāo)記的的親環(huán)素衍生物與細(xì)胞內(nèi)的親環(huán)素結(jié)合分析顯示化合物 8 的細(xì)胞膜通透性比 CsA 低 50 倍左右。但是令人驚喜的是，盡管化合物 8 主要是限制在細(xì)胞外間隙的，但是化合物 8 依然能抑制親環(huán)素 A 進(jìn)而抑制白細(xì)胞的遷移。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)這個抑制劑還可以減少白細(xì)胞的活化。

圖 10 化合物 7、8、9 和 10 的結(jié)構(gòu)Fig. 10 Structure of compound 7, 8, 9 and 10

3.3 其他位置改造的環(huán)孢菌素類衍生物

雖然 Scynexis 公司探索 P5 位烷基化影響CsA 的免疫抑制活性和抗病毒活性的專利數(shù)據(jù)不詳。 但在上世紀(jì)末山德士公司的科學(xué)家已經(jīng)證明這個位置的游離 NH 基的烷基化可以影響環(huán)孢菌素衍生物的構(gòu)像和免疫抑制活性[88,89]?；衔?1(圖 11)就是通過二甲基烯丙基溴的烷基化來合成，這個 CsA 衍生物被報道對親環(huán)素 A 和 D有較好的親和力(＜60 nmol/L)。因為像 P3 氨基酸、P8 氨基酸已經(jīng)被定位在鈣調(diào)磷酸酶(P4-P7)結(jié)合域的邊緣，所以 Scynexis 公司使用類似于 Eberle公司探索 P8 位置修飾的環(huán)孢素所介紹的方法(圖12)研究了這個位置的構(gòu)效關(guān)系[90,91]。他們的研究結(jié)果建議可以通過在這個位置接入堿性的基團(tuán)來改造親環(huán)素 A 結(jié)合活性、免疫抑制活性和抗病毒活性。研究發(fā)現(xiàn)代表性的化合物 12(圖 11)的抗HCV 活性比 CsA 高且免疫抑制活性也低于 CsA 。

4 影響環(huán)孢菌素與親環(huán)素和鈣調(diào)磷酸激酶親和力因素

環(huán)孢菌素 A 結(jié)構(gòu)的 P1、P2、P9、P10 和 P11氨基酸是環(huán)孢菌素 A 與 CyP 的結(jié)合區(qū)，所以修飾這些位置的氨基酸往往可以提高環(huán)孢菌素衍生物對親環(huán)素的結(jié)合力。P4-P7 位的氨基酸是與 CaN作用的效應(yīng)區(qū)，CsA 和 CyP 的結(jié)合是產(chǎn)生抑制CaN 活性的基礎(chǔ)，修飾上述位置往往會影響環(huán)孢菌素與親環(huán)素的構(gòu)像，但是更大程度上會改變其結(jié)合鈣調(diào)磷酸激酶的活性。

圖 11 化合物 11 和 12 的結(jié)構(gòu)Fig. 11 Structure of compound 11 and 12

圖 12 環(huán)孢菌素在 P8 位改造的方法Fig. 12 Production of P8-modified cyclosporins

在環(huán)孢菌素 A 與 CyP 的結(jié)合區(qū)中對親和作用有重要貢獻(xiàn)的是 P1 位 MeBmt 氨基酸，MeBmt氨基酸結(jié)構(gòu)與 CyP 的最適底物結(jié)構(gòu)相似，形成的過渡態(tài)能量最低最穩(wěn)定，這對 CsA 和 CyP 的高親和力是很重要的。一般來說 MeBmt 的改造往往會降低 CsA 衍生物對親環(huán)素的親和力。例如刪掉或改變 MeBmt 中甲基立體構(gòu)型，甚至是增加一個甲基都會降低其親和力。同樣如果 MeBmt的羥基去掉或者被保護(hù)都會降低其與親環(huán)素親和力。最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用生物電子等排體 S 取代雙鍵位置，其與親環(huán)素的親和力會增加 78%。具體的結(jié)構(gòu)改造結(jié)果可見圖 13。

如上文所述，對 CsA 的結(jié)構(gòu)改造熱點是尋找高效低毒非免疫抑制的親環(huán)素抑制劑，其關(guān)鍵就是減弱甚至去除鈣調(diào)磷酸激酶的親和力。因為 P4 位置甲基化亮氨酸與鈣調(diào)磷酸激酶的 Trp352和 Phe356有氫鍵作用，所以最有效的辦法可能就是改造 P4位置的氨基酸。研究報道將亮氨酸換為異亮氨酸的時候，這個衍生物(NIM-811)就失去了免疫抑制活性，但是仍然保留著與 CsA 相似的親環(huán)素結(jié)合活性。具體的 P4-P7 位置的構(gòu)效關(guān)系總結(jié)在圖 13 中。

圖 13 環(huán)孢菌素與親環(huán)素和鈣調(diào)磷酸激酶的構(gòu)效關(guān)系Fig. 13 CypA and CaN binding SAR of CsA derivatives

5 結(jié)論與展望

自從在 30 年前發(fā)現(xiàn)第一個免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物，藥物化學(xué)家對有臨床效應(yīng)的親環(huán)素抑制劑的安全鑒定有了巨大的進(jìn)步，環(huán)孢菌素的結(jié)構(gòu)修飾幫助科學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素未知的生物功能。已經(jīng)有了幾個此類的分子進(jìn)入到用于病毒感染治療的臨床試驗。為了更進(jìn)一步了解親環(huán)素抑制劑的結(jié)構(gòu)多樣性，更多的非免疫抑制環(huán)孢菌素衍生物需要開發(fā)。

在這過程中發(fā)現(xiàn)的更好的化合物會被安排進(jìn)入治療丙型肝炎感染或心肌再灌注損傷治療的臨床試驗中。據(jù)我們所知，所有研究發(fā)現(xiàn)的親環(huán)素抑制劑至少都是親環(huán)素 A、B 和 F 的有效抑制劑，一個選擇性抑制親環(huán)素的分子急需開發(fā)出來。非環(huán)孢菌素類親環(huán)素抑制劑的開發(fā)可能會是尋找選擇性親環(huán)素抑制劑的趨勢。目前許多親環(huán)素脯氨酰異構(gòu)酶活性的小分子拮抗劑已被報道，我們熱切期待這些分子的出現(xiàn)引領(lǐng)新一代生化工具和臨床藥物的發(fā)展[92]。

2010 年，西班牙藥物化學(xué)家 Mu?oz 等[93]研究了環(huán)孢菌素 A 的廣譜抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其對人腦膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和胰腺、喉、胃及結(jié)腸癌細(xì)胞都具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，并發(fā)現(xiàn)這些作用主要介導(dǎo) NK-1 受體而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。2012 年，韓國科學(xué)家 Jeon 等[94]研究了環(huán)孢菌素 A 對前列腺癌的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑制作用并阻滯細(xì)胞周期在 G1 期。深入的凋亡機(jī)制發(fā)現(xiàn) CsA 是通過 CaMKII 介導(dǎo)而激活 AMPK 從而抑制前列腺癌細(xì)胞 mTORC1 信號殺死前列腺癌細(xì)胞。這些工作為 CsA 往抗腫瘤方向的發(fā)展開辟了先河。

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Nonimmunosuppressive Cyclophilin Inhibitors Derived from the Cyclosporin Scaffolds

YAO Guiyang1FANG Lijing1PAN Zhengyin1Wang Hengshan2SU Wu1

1(Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)
2(School of Chemistry & Pharmaceutical Sciences of Guangxi Normal University,Guilin541004,China)

Cyclophilins (Cyps) are crucial to protein folding because that the ubiquitous proteins affect the cis-trans isomerization of Pro amide bonds. The immunosuppressive natural product cyclosporine A inhibits the enzymatic activity of the cyclophilins. Chemical modification of cyclosporine scaffolds has produced many analogues that inhibit cyclophilins in vitro but have reduced immunosuppressive properties. Three nonimmunosuppressive cyclophilin inhibitors (alisporivir, SCY-635, and NIM811) have demonstrated clinical efficacy for the treatment of hepatitis C infection. Recent publications suggest that cyclophilin inhibitors may have utility for the treatment of diverse viral infections, inflammatory indications, and cancer. In this review, we document the structure-activity relationships of the nonimmunosuppressive cyclosporins in clinical and preclinical development. Aspects of the pharmacokinetic behavior and chemical biology of these drug candidates are also described.

cyclophilins; cyclosporine A; nonimmunosuppressive; antiviral; structure-activity relationships

R 914.5

A

2015-04-21

：2015-05-10

深圳市引進(jìn)海外高層次人才“孔雀計劃”(KQCX20130628112914285)；國家自然科學(xué)基金(21432003)

姚貴陽，博士研究生，研究方向為多肽藥物的合成及開發(fā)；房麗晶，博士，助理研究員，研究方向為多肽藥物的合成及開發(fā)；潘正銀，碩士，多肽藥物的合成及開發(fā)；王恒山，博士，教授，研究方向為手性藥物的開發(fā)研究；粟武(通訊作者)，博士，研究員，研究方向新藥研發(fā)以及磁性納米材料應(yīng)用于醫(yī)學(xué)成像和藥物靶向運輸， E-mail：wu.su@siat.ac.cn。