侯瑩瑩，趙 巖，唐國勝，郭 帥，韓玲玲，李學軍，張志東，楊 鶴，劉雙利，張連學

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 康美新開河(吉林)藥業(yè)有限公司，吉林 集安 134200)

中心組合設(shè)計-響應(yīng)曲面法優(yōu)化淫羊藿苷超聲波提取工藝

侯瑩瑩1，趙 巖1，唐國勝1，郭 帥1，韓玲玲1，李學軍2，張志東2，楊 鶴1，劉雙利1，張連學1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 康美新開河(吉林)藥業(yè)有限公司，吉林 集安 134200)

【目的】 采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿苷的超聲波提取工藝?！痉椒ā?在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計方法，研究了乙醇用量、超聲提取時間、液(mL)固(g)比及其交互作用對淫羊藿苷提取率的影響?！窘Y(jié)果】 通過嶺脊分析確定的淫羊藿苷最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分數(shù)68%、超聲提取時間23 min、液(mL)固(g)比32∶1， 該條件下淫羊藿苷的提取率可達到0.661%，與理論值0.663%十分接近?！窘Y(jié)論】 確定了淫羊藿苷的最佳提取工藝，該工藝具有耗時短、提取率高、能量消耗少且工藝穩(wěn)定可靠等優(yōu)點。

淫羊藿；淫羊藿苷；提取工藝；中心組合設(shè)計；響應(yīng)面分析

淫羊藿(Epimediumbrevicornumaxim)又稱仙靈脾，為小檗科(Berberidaceae) 淫羊藿屬(Epimedium)多年生草本植物，在中國已有2 000多年的藥用歷史[1]，主要分布在中國的黑龍江、吉林、遼寧、山東、江西等地[2]。淫羊藿中的主要活性成分是以淫羊藿苷為代表的黃酮苷類化合物，淫羊藿苷具有改善心腦血管功能、促進性腺功能、增強機體免疫力、延緩衰老、抗腫瘤等生理活性[3-12]。

目前，關(guān)于淫羊藿苷的提取工藝已有一些相關(guān)報道[13-16]，試驗多采用均勻設(shè)計法和正交實驗法，但這2種方法均存在一定的不足。均勻設(shè)計法的目的是在盡量減少實驗次數(shù)的同時盡可能多地考察實驗因素，再加上可能要引入某些因素的平方項或交叉乘積項作為派生的“自變量”，會導致自變量個數(shù)太多，而使獲得的多重線性回歸方程不唯一，同時不同的研究結(jié)果彼此之間可能會相差懸殊。正交實驗當試驗需考察的因素較多并且每個因素都有多個水平時，為了照顧整齊可比，試驗就無法充分地均勻分散，并且試驗的次數(shù)會很多(試驗次數(shù)隨水平數(shù)的平方而增加)，從而導致試驗難以安排。響應(yīng)面分析法是基于合理的試驗設(shè)計，利用試驗得到的相關(guān)數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問題的一種重要的統(tǒng)計方法[17-18]，它具有試驗次數(shù)少，試驗精度高等特點，在藥學上應(yīng)用成效顯著。本研究采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化了淫羊藿苷的超聲提取工藝，以期為淫羊藿苷的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 淫羊藿苷 淫羊藿苷購于上海萊雀生物科技有限公司，純度大于98%。

1.1.2 淫羊藿 淫羊藿采收于吉林省臨江市，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學張連學教授鑒定為淫羊藿(Epimediumbrevicornumaxim)，試驗前篩選去梗、去莖、曬干，粉碎過孔徑0.90 mm的篩后，陰涼處保存。

1.1.3 儀器與試劑 CXTH-3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；DHG-9140A型恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ABS 320-4N型分析天平(上海島韓實業(yè)有限公司)；酒精計(河北省滄縣杜生熱工儀表廠)。乙腈，色譜純；其他試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 淫羊藿苷標準曲線的建立

用甲醇精確配制0.3 μmol/mL的淫羊藿苷標準液，備用。精密吸取淫羊藿苷標準液0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mL，分別用甲醇定容在1 mL容量瓶中，配制成0.003，0.015，0.030，0.150和0.300 μmol/mL的淫羊藿苷標準工作液。取淫羊藿苷標準工作液進行高效液相色譜(HPLC)分析，以淫羊藿苷峰面積為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)，進行線性回歸分析，得到的回歸方程為y=4E-08x-0.000 8(R2=0.999 6)，說明在0.003～0.300 0 μmol/mL范圍內(nèi)，淫羊藿苷濃度與HPLC峰面積呈良好的線性關(guān)系。

HPLC條件：色譜柱為大連江申分離科學技術(shù)公司C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相乙腈-水(V(乙腈)∶V(水)=25.5∶74.5)；檢測波長270 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL。

1.3 淫羊藿苷的提取及測定

精密稱取淫羊藿粉末0.5 g，置于三角瓶中，按一定的液(mL)固(g)比(下文簡稱液固比)加入不同體積分數(shù)的乙醇，按設(shè)定時間超聲提取，過濾，濾液用尼龍膜再次過濾，取濾液作為供試品溶液。

取0.3 μmol/mL對照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別進行HPLC分析，記錄色譜圖，計算供試品中淫羊藿苷的提取率。

1.4 淫羊藿苷提取工藝的單因素試驗

對超聲提取的乙醇用量、超聲提取時間、液固比分別進行單因素試驗，考察這3個因素對淫羊藿苷提取率的影響。

1.4.1 乙醇體積分數(shù)的影響 超聲提取時間固定為20 min，液固比為40∶1，乙醇體積分數(shù)分別為0，20%，40%，60%，80%和95%，試驗重復6次。

1.4.2 超聲提取時間的影響 固定乙醇體積分數(shù)為60%，液固比為40∶1，超聲提取時間分別為5，10，20，40，60和80 min，試驗重復6次。

1.4.3 液固比的影響 固定乙醇體積分數(shù)為60%，超聲提取時間為20 min，液固比分別為5∶1，10∶1，20∶1，40∶1，60∶1和80∶1，試驗重復6次。

1.5 淫羊藿苷提取工藝的中心組合設(shè)計-響應(yīng)曲面法優(yōu)化

為了分析各因素及其交互作用對淫羊藿苷提取率的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以淫羊藿苷提取率為考察目標，進行中心組合試驗設(shè)計，中心組合設(shè)計各因素水平詳見表1，中心組合設(shè)計見表2，并依據(jù)表2進行17次試驗。利用SAS軟件的RSREG(二次響應(yīng)面回歸模型)程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行響應(yīng)面分析，用嶺脊分析優(yōu)化試驗工藝，采用ORIGIN軟件繪制響應(yīng)面曲面圖。

表1 淫羊藿苷提取工藝中心組合設(shè)計的因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design for the extraction process of the icariin

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿苷提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對淫羊藿苷提取率的影響 由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)低于60%時，隨著其用量的升高，淫羊藿苷提取率增加；但當乙醇體積分數(shù)高于60%時，隨著乙醇用量的升高，淫羊藿苷的提取率反而降低?？紤]到實際生產(chǎn)，乙醇回收的耗能問題，應(yīng)盡可能選擇高含量乙醇進行提取，因此乙醇體積分數(shù)以20%～95%為佳。

2.1.2 超聲提取時間對淫羊藿苷提取率的影響 由圖2可知，整體趨勢上，隨著超聲提取時間的延長，樣品中淫羊藿苷的提取率也隨之提高。超聲提取時間在5～20 min，提取率增加相對緩慢；在20～40 min，提取率增加較快，在40～80 min，提取率增加緩慢。考慮到實際生產(chǎn)中的耗能等問題，在保證提取率的前提下，應(yīng)盡可能選擇較短的超聲時間，故超聲提取時間以5～40 min為宜。

2.1.3 液固比對淫羊藿苷提取率的影響 由圖3可

知，液固比在(5∶1)～(10∶1)時，淫羊藿苷提取率增加緩慢；在(10∶1)～(40∶1)時，淫羊藿苷提取率增加幅度較大；在(40∶1)～(60∶1)時，提取率增加緩慢；液固比大于60∶1時，提取率有降低的趨勢。考慮到實際生產(chǎn)中的溶劑回收問題，應(yīng)盡量選擇較小的液固比，故液固比考察范圍以(10∶1)～(60∶1)為宜。

圖1 乙醇體積分數(shù)對淫羊藿苷提取率的影響

圖2 超聲提取時間對淫羊藿苷提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic extraction time on extraction rate of icariin

圖3 液(mL)固(g)比對淫羊藿苷提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of icariin

2.2 淫羊藿苷提取工藝的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析

2.2.1 試驗方案及結(jié)果 淫羊藿苷提取工藝中心組合設(shè)計試驗結(jié)果見表2。

表2 淫羊藿苷提取工藝中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of central composite design for the extraction process of icariin

表3 淫羊藿苷提取率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Significance of regression coefficients for the extraction data icariin

注：*表示顯著(P<0.05)， **表示極顯著(P<0.01)；在P<0.2水平上拒絕假設(shè)。

Note:*Indicatessignificantdifference(P<0.05),**Indicatesextremelysignificantdifference(P<0.01);AtP<0.2level,hypothesiswasrejected.

表4 淫羊藿苷提取率回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equations for the extraction data of icariin

注：**表示極顯著(P<0.01)。

Note:**Indicatesextremelysignificantdifference(P<0.01).

從表4可以看出，總模型、線性項、平方項的P<0.001，表明總模型和方程的線性項、平方項對淫羊藿苷提取率的影響極顯著；而方程的交互項的P>0.05，表明其對提取率的影響不顯著。相關(guān)性分析中，總模型的復相關(guān)系數(shù)R2=0.957 4，表明回歸方程對淫羊藿苷提取率的預(yù)測值與實測值有較好的相關(guān)性。失擬性檢驗分析結(jié)果顯示P=0.058>0.05，表明失擬性不顯著，該回歸方程無失擬因素存在，回歸方程與實測值能較好地擬合。

表5 淫羊藿苷提取率模型的嶺脊回歸分析Table 5 Ridge analysis of maximum responses for the extraction data of icariin

根據(jù)回歸分析結(jié)果，運用ORIGIN軟件繪制響應(yīng)曲面圖，即淫羊藿苷提取率y與乙醇體積分數(shù)x1、超聲提取時間x2、液固比x3構(gòu)成的三維空間圖形。為了更直觀地表現(xiàn)2個因素同時對淫羊藿苷提取率的影響，可以令第3個因素水平值在中心點(即編碼水平為0)，僅考慮該2個因素對提取率的影響,結(jié)果見圖4～6。由圖4～6可知，3個響應(yīng)面圖形均開口向下，可以直觀地得出淫羊藿苷提取率的較優(yōu)提取工藝條件為：x160%～70%、x215～25min、x3(25∶1)～(35∶1) 。

由嶺脊分析結(jié)果(表5)可知，回歸方程預(yù)測的淫羊藿苷的最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)68%、超聲提取時間為23min、液固比為32∶1。為驗證模型的有效性，在上述條件下，進行3次重復性試驗，結(jié)果淫羊藿苷提取率分別為0.671%，0.665%和0.647%，平均值為0.661%，試驗值與預(yù)測值擬合良好，也進一步說明了模型的可行性。

圖4 乙醇體積分數(shù)為57.5%時超聲提取時間和液(mL)固(g)比對淫羊藿苷提取率的影響

圖5 超聲提取時間為22.5 min時乙醇體積分數(shù)和液(mL)固(g)比對淫羊藿苷提取率的影響Fig.5 Responsive surface plot for ethanol concentration and liquid to solid ratio of icariin (Fixed ultrasonic extraction time=22.5 min)

圖6 液固比為35∶1時乙醇體積分數(shù)和超聲提取時間對淫羊藿苷提取率的影響Fig.6 Responsive surface plot for ethanol concentration and ultrasonic extraction time of icariin (Fixed liquid to solid ratio=35∶1)

3 討論與結(jié)論

本試驗選擇超聲提取法提取淫羊藿苷，考察對象為乙醇用量、超聲時間、液固比3個影響因素，采用中心組合試驗設(shè)計對單因素及其相互作用進行探討，并通過中心組合設(shè)計-響應(yīng)面分析方法，建立了超聲輔助提取淫羊藿苷的數(shù)學模型，回歸方程的復相關(guān)系數(shù)為0.957 4，方程擬合良好。通過嶺脊分析優(yōu)化出超聲波提取淫羊藿苷的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)68%、超聲提取時間23min、液固比 32∶1。

目前，淫羊藿苷的提取大多數(shù)研究都選用均勻設(shè)計和正交試驗設(shè)計的方法進行實驗[13-16,19-20]，雖然這2種方法基本可以滿足一般試驗的要求，但還存在一些問題，如試驗的精度不夠，無法精確找到最佳條件。如賈恒明等[19]采用正交設(shè)計優(yōu)選淫羊藿苷提取工藝，確定的最佳條件為：用水浸泡12h，用8倍量的70%乙醇熱回流提取2次,1.5h/次, 與本試驗確定的工藝相比存在操作較繁瑣、提取時間相對較長、耗能較多等不足。

綜上可知，本試驗通過中心組合設(shè)計-響應(yīng)曲面法確定的淫羊藿苷超聲波提取工藝，具有提取效率高、時間短、耗能少等優(yōu)點，并且采用的方法為純物理方法，保證了化學成分的穩(wěn)定，這為淫羊藿苷簡便、高效的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能，也為深入研究淫羊藿苷的藥理功能及促進淫羊藿藥材的有效利用奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of icariin extraction fromEpimediumbrevicornumaximby supersonic wave using central composite design and response surface methodology

HOU Ying-ying1,ZHAO Yan1,TANG Guo-sheng1,GUO Shuai1,HAN Ling-ling1,LI Xue-jun2,ZHANG Zhi-dong2,YANG He1,LIU Shuang-li1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2KangmeiXinkaihe(Jilin)PharmaceuticalCompanyLimited,Ji’an,Jilin134200,China)

【Objective】 The ultrasound-assisted extraction of icariin fromEpimediumbrevicornuMaximwas optimized using response surface methodology and central composite design (CCD).【Method】 Based on single factor tests,the effects of ethanol concentration,ultrasonic extraction time,liquid to solid ratio and their interactions on extraction rate were studied using CCD method.【Result】 The optimal ultrasonic extraction conditions based on ridge analysis were:ethanol concentration 68%,ultrasonic extraction time 23 min,liquid to solid ratio 32 mL/g.Under the optimum conditions,the extraction yield of total icariin was 0.661%,which was close to the theoretical value of 0.663%.【Conclusion】 The optimal extraction conditions of epimedium glycoside extraction were determined and the advantages included short time,high extraction efficiency,less energy consumption,stable,and reliable.

Epimediumbrevicornumaxim;icariin;extraction technique;central composite design;response surface analysis

時間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.024

2014-01-20

國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B01)；國家公益性行業(yè)科研專項(201303111)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20126046)；吉林省中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(YYZX201258)

侯瑩瑩(1990-)，女，吉林吉林人，碩士，主要從事天然藥物化學成分提取與生物活性研究。E-mail：zmlhyy@126.com

趙 巖(1979-)，男，吉林長春人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學成分提取與生物活性研究。 E-mail：zhyjlu79@163.com

R284.2

A

1671-9387(2015)10-0175-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.048.html