譙天敏，張 靜，冉曉瀟，朱天輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 成都 611130)

解淀粉芽孢桿菌在山茶葉中的定殖及對(duì)山茶灰斑病的防效

譙天敏，張 靜，冉曉瀟，朱天輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 成都 611130)

【目的】 解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是從山茶葉片內(nèi)部分離得到的1株內(nèi)生拮抗菌株，通過研究該菌株在山茶葉片表面和內(nèi)部的定殖規(guī)律及其對(duì)山茶灰斑病的田間防治效果，為新型生防制劑的開發(fā)及山茶灰斑病的生物防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā?采用抗生素標(biāo)記法，結(jié)合比較標(biāo)記菌株和非標(biāo)記菌株的形態(tài)特征、拮抗能力、防病效果，篩選出最佳標(biāo)記菌株；分別采用噴施和針刺法研究接種濃度、病原菌對(duì)生防菌在山茶葉表面及內(nèi)部定殖動(dòng)態(tài)的影響，并測(cè)定生防菌對(duì)山茶灰斑病的田間防治效果?！窘Y(jié)果】 從含500 μg/mL鏈霉素抗性平板上得到最佳標(biāo)記菌株，標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株在形態(tài)特征、拮抗能力、防病效果方面均無明顯差異。定殖試驗(yàn)表明，解淀粉芽孢桿菌能夠高效定殖于山茶葉表面及內(nèi)部，且葉表面的定殖較葉片內(nèi)部更為高效、持久，其定殖量與接種濃度呈正相關(guān)，并在一定時(shí)間內(nèi)維持相當(dāng)數(shù)量，病原菌僅與葉表面定殖密切相關(guān)，與生防菌的葉內(nèi)定殖無關(guān)。田間防治試驗(yàn)表明，生防菌解淀粉芽孢桿菌菌懸液對(duì)山茶灰斑病有顯著生防效果，預(yù)先接種生防菌菌懸液后再接種病原菌的生防效果最好，防效為75.35%，先接種病原菌后噴施解淀粉芽孢桿菌菌懸液處理的防效為73.89%，同時(shí)接種生防菌菌懸液和病原菌時(shí)的防效最低，為72.95%?！窘Y(jié)論】 生防菌株B.amyloliquefaciens能夠有效定殖于山茶葉片表面及內(nèi)部，且對(duì)山茶灰斑病具有顯著的生物防治效果。

山茶灰斑病；芽孢桿菌；茶褐斑擬盤多毛孢菌；生物防治；定殖能力

山茶灰斑病(Camellia gray spot)是由茶褐斑擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey)侵染所引起的一種葉部真菌性病害[1-2]。山茶灰斑病病原體在葉組織中以菌絲或分生孢子盤形式越冬，翌年春天產(chǎn)孢，造成擴(kuò)散性為害傳播[3]。受侵染的山茶植株輕者葉、梢干枯，重者整株死亡，極大地降低了山茶的經(jīng)濟(jì)及觀賞價(jià)值[4]。目前，對(duì)該病的防治報(bào)道主要集中在化學(xué)防治方面[5]，尚未發(fā)現(xiàn)理想藥劑及抗病品種，生物防治尚屬空白。

芽孢桿菌作為新一類生防資源，對(duì)多種植株病害均具有明顯的防控作用[6]。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)病原菌生防機(jī)制的研究主要集中在促生增強(qiáng)[7]、競(jìng)爭定殖[8]、拮抗互作[9]和誘導(dǎo)抗性[10]4個(gè)方面。范曉靜等[11]、閆孟紅等[12]、孔慶科等[13]研究顯示，相較于根際細(xì)菌來說，內(nèi)生細(xì)菌適應(yīng)微環(huán)境能力較強(qiáng)，可大大降低外界環(huán)境對(duì)自身的影響，因此研究內(nèi)生細(xì)菌的競(jìng)爭定殖作用對(duì)其生防制劑的開發(fā)意義重大。解淀粉芽孢桿菌是從山茶葉片內(nèi)部分離得到的1株內(nèi)生拮抗菌株，具有繁殖能力強(qiáng)、抗逆性顯著、生防潛力大等基本特性[14-15]，且對(duì)多種病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。近年來，對(duì)解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)生物學(xué)特性的研究較多[16]，但在其定殖和生物防治方面報(bào)道甚少。本研究在對(duì)解淀粉芽孢桿菌抗生素突變菌株篩選的基礎(chǔ)上，研究該菌在山茶葉表面和內(nèi)部的定殖力，檢測(cè)其對(duì)山茶灰斑病的田間防治效果，旨在為解淀粉芽孢桿菌生防制劑的高效開發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)為山茶灰斑病的生物防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA10菌株，病原菌為茶褐斑擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試植株 西南紅山茶，即七心紅(Camelliapitardii),4年生，購于雅安花卉公司，種植于田間，行距1 m，株距0.5 m。

1.1.3 菌懸液制備 將活菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，收集分生孢子，用無菌水稀釋成3×104CFU/mL的孢子懸液。將斜面上培養(yǎng)2 d的解淀粉芽孢桿菌BA10菌株接種于NA培養(yǎng)液中，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)72 h，制成2×107CFU/mL的菌懸液 (用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)初始菌液帶菌量)。

1.1.4 抗生素 卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素、林可霉素、慶大霉素和阿米卡星，均購自上海生物試劑公司。制備的10 μg/mL抗生素溶液經(jīng)抗菌過濾膜(0.22 μm)抽濾、滅菌后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 拮抗菌抗生素突變體的誘發(fā)、篩選

將解淀粉芽孢桿菌分別接種于7種抗生素抗性平板上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行供試菌株的天然抗藥性檢測(cè)，確定抗生素標(biāo)記種類及初篩質(zhì)量濃度。每組抗生素濃度梯度分別為10,20,50,100 μg/mL。以不加抗生素平板為空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。在此基礎(chǔ)上參照郭小芳等[17]的方法，進(jìn)行拮抗菌抗生素突變體的篩選。將解淀粉芽孢桿菌BA10菌株落依次接種于10,20,40,60,80,100 μg/mL初篩抗性平板上培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定的突變體菌株。

1.3 BA10標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株的比較

1.3.1 菌落形態(tài)特征 將標(biāo)記菌株(1.2中篩選的突變體)與未標(biāo)記菌株(原始拮抗菌)分別進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，觀察菌落形態(tài)特征是否發(fā)生變化。

1.3.2 拮抗活性 將標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.3.1節(jié)，觀察并對(duì)比培養(yǎng)皿中拮抗帶寬度的變化，計(jì)算抑制率(抑制率=(對(duì)照病原菌直徑-對(duì)峙培養(yǎng)病原菌直徑)/對(duì)照病原菌直徑×100%)均值，探究標(biāo)記菌株的拮抗活性，以此判斷該菌是否適合應(yīng)用于山茶葉片的定殖和生物防治。

1.3.3 防病效果 將未標(biāo)記菌株與標(biāo)記菌株在平板上連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)3次后，接種到斜面培養(yǎng)基上，于-4 ℃下保存30 d，活化制成濃度為2×107CFU/mL的菌懸液，分別噴施未標(biāo)記菌株和標(biāo)記菌株菌懸液100 mL于山茶葉片表面后，立即接種濃度為3×104CFU/mL的病原菌孢子懸液100 mL。分別在接種后第1,4,8,15天進(jìn)行標(biāo)記性狀的穩(wěn)定性檢測(cè)，計(jì)算防效[3]，每株取樣本15片，每處理3次重復(fù)。

1.4 標(biāo)記菌株在山茶葉部定殖力的測(cè)定

1.4.1 接種濃度對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉表面及葉內(nèi)定殖的影響 以無菌水稀釋解淀粉芽孢桿菌菌懸液至濃度梯度為2×104，2×105，2×106，2×107CFU/mL。(1)葉表面定殖力測(cè)定。每梯度各取100 mL，分別噴施于已消毒(體積分?jǐn)?shù)75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3～5次)山茶葉片表面。(2)葉內(nèi)定殖力的測(cè)定。采用針刺傷葉接種法，具體參照Pedras等[18]對(duì)番茄葉片針刺的方法，選擇長勢(shì)相近的健康山茶植株10株，每株隨機(jī)選擇4片2年生葉片，分別用已消毒的微量進(jìn)樣器(0.05 mm)注射各梯度菌劑于葉內(nèi)，每葉片注射1孔，每孔注射量為15 mL，3組重復(fù)，以注射等量無菌水為對(duì)照。無菌套袋15 d后拆袋，在拆袋后1，4，8，12，16，20，28，40 d時(shí)取山茶葉片，將葉片剪碎后取碎葉片5 g，研磨獲得葉汁。取葉汁0.2 mL梯度稀釋后的洗滌液涂抹于抗生素平板，每梯度重復(fù)3組，25 ℃培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.4.2 病原菌對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉表面及葉內(nèi)定殖的影響 處理方法同1.4.1。葉片表面定殖力測(cè)定共設(shè)4個(gè)處理：(1)PB,先施生防菌處理。噴施2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL，7 d后噴施3×104CFU/mL病原菌孢子懸液100 mL；(2)P+B，同時(shí)施用生防菌和病原菌處理。同時(shí)噴施2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液和3×104CFU/mL病原菌孢子懸液各100 mL； (3)BP，先施病原菌處理。噴施3×104CFU/mL 病原菌孢子懸液100 mL，7 d后噴施2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL；(4)CK,只施生防菌。噴施2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL，7 d后噴施無菌水100 mL。葉片內(nèi)部定殖力測(cè)定的處理方法同上，只是將各處理中噴施的2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL改為接種該菌懸液15 mL。

1.4.3 解淀粉芽孢桿菌對(duì)山茶灰斑病的防治效果 對(duì)已滅菌葉片的試驗(yàn)處理共分5組，每處理10株，3個(gè)重復(fù)。處理1(預(yù)先接種病原菌)：先噴施3×104CFU/mL 的病原菌孢子懸液100 mL，7 d后再噴施2×107CFU/mL解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL于山茶葉片表面；處理2(同時(shí)接種生防菌與病原菌)：先噴施3×104CFU/mL病原菌孢子懸液100 mL后，立即噴施2×107CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL于葉片表面；處理3 (預(yù)先接種生防菌)：先噴施2×107CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌菌懸液100 mL，7 d后再噴施3×104CFU/mL的病原菌孢子懸液100 mL于葉片表面；處理4：噴施3×104CFU/mL 的病原菌孢子懸液100 mL；處理5：噴施清水。以上各處理組在處理、對(duì)照、重復(fù)期間均需無菌套袋處理，在接種完成后的第8天開始再無菌套袋培養(yǎng)15 d，分別于拆袋后的0，5，10，15，20 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。對(duì)未滅菌葉片的試驗(yàn)處理，除在噴施菌液前需用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精對(duì)葉片進(jìn)行表面消毒外，其他步驟同上。參照李姝江等[3]的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)和防病效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌抗生素種類及突變體的篩選

抗生素標(biāo)記試驗(yàn)表明，解淀粉芽孢桿菌在鏈霉素質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)菌落生長較好，但在更高質(zhì)量濃度下無法生長；在含10 μg/mL阿米卡星平板上也能產(chǎn)生單菌落，但菌落較為稀疏；在10，20，50，100 μg/mL的林可霉素抗性平板上均可生長，而在其余抗生素平板均不能生長。由此可知，鏈霉素是標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌的最佳抗生素，初篩質(zhì)量濃度為10 μg/mL。在此基礎(chǔ)上，依次劃線向更高質(zhì)量濃度的鏈霉素抗性平板上培養(yǎng)，直至不再長出菌落為止，最終在含500 μg/mL鏈霉素抗性平板上得到目的菌株。

2.2 標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株的比較

2.2.1 菌落形態(tài)特征 劃線培養(yǎng)2 d后，標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株相似，但顏色略顯暗淡，出現(xiàn)不透明白色菌落。在顯微鏡下觀察其形如桿狀，表體不光滑，菌落邊緣不整齊，與未標(biāo)記菌株大體一致。

2.2.2 拮抗能力 對(duì)峙培養(yǎng)比較發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記菌株抑菌圈直徑均值達(dá)到1.55 cm，抑菌率均值達(dá)到73.23%；而未標(biāo)記菌株的抑菌圈直徑均值達(dá)到 1.59 cm，抑菌率均值達(dá)到75.89%，說明標(biāo)記后菌株對(duì)病原菌的抑制作用并未受到太大的影響，可用于山茶灰斑病的定殖和生防研究。

2.2.3 防病效果 由表1可知，標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株對(duì)山茶灰斑病的生防效果幾乎一致，推斷標(biāo)記菌株仍具有較強(qiáng)的生防活性，可以作為抗性標(biāo)記菌株進(jìn)行定殖試驗(yàn)研究。

表1 標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株對(duì)茶褐斑擬盤多毛孢菌的防效Table 1 Control effects of unmarked strain and marked strain against Pestalotipsis guepini

注:表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值；小寫英文字母表示0.05顯著差異水平(SSR測(cè)驗(yàn))。

Note:All data are the average of three repeats.Small letters mean significant difference at 0.05 level (SSR test).

2.3 接種濃度對(duì)生防菌定殖的影響

2.3.1 對(duì)山茶葉片表面定殖的影響 圖1表明，生防菌在山茶葉片上的定殖量與其接種濃度明顯相關(guān)，接種初始濃度越高，生防菌的定殖量越大，定殖能力越強(qiáng)；當(dāng)生防菌定殖量達(dá)到最大時(shí)，其數(shù)值均略高于拆袋后第1天的接種量，且增量高低與初始濃度值呈負(fù)相關(guān)；在檢測(cè)周期內(nèi)， 4種不同接種濃度處理幾乎同時(shí) (8 d左右)達(dá)到菌量最大值，后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，最終趨于平穩(wěn)；2×107CFU/mL和2×106CFU/mL的定殖濃度較其他2組處理具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以作為田間定殖和防治的優(yōu)選濃度。

圖1 接種濃度對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉片表面定殖的影響B(tài).葉部菌量；B7.2×107 CFU/mL；B6.2×106 CFU/mL；B5.2×105 CFU/mL；B4.2×104 CFU/mLFig.1 Effect of inoculated concentration on colonization of Bacillus amyloliquefaciens on leaves of camellia B.Concentration of strains on leaves;B7.2×107 CFU/mL;B6.2×106 CFU/mL;B5.2×105 CFU/mL;B4.2×104 CFU/mL

圖2 接種濃度對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉片內(nèi)部定殖的影響B(tài).葉部菌量；B7.2×107 CFU/mL；B6.2×106 CFU/mL；B5.2×105 CFU/mL；B4.2×104 CFU/mLFig.2 Effect of inoculated concentration on colonization of Bacillus amyloliquefaciens in leaves of camelliaB.Concentration of strains in leaves;B7.2×107 CFU/mL;B6.2×106 CFU/mL;B5.2×105 CFU/mL;B4.2×104 CFU/mL

2.3.2 對(duì)山茶葉內(nèi)定殖的影響 圖2顯示，不同接種濃度下生防菌定殖量隨時(shí)間變化曲線的波動(dòng)差別較為明顯，生防菌定殖量的高低與接種濃度呈正相關(guān)，即接種濃度越高生防菌在山茶葉內(nèi)的定殖量也就越大，接種濃度低則生防菌的定殖量?。桓鹘臃N濃度下定殖量的峰值，均大幅度高于第1天的定殖量；拆袋16 d后隨接種時(shí)間的延長，定殖菌量急劇減少。

由圖2可知，與葉表面定殖相比，葉片內(nèi)部定殖的菌量變化不明顯，拆袋16 d后才達(dá)到最大峰，明顯較葉表面定殖時(shí)的最大值出現(xiàn)晚，且葉表面定殖的菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉內(nèi)部定殖的菌量。由圖2可以進(jìn)一步看出，內(nèi)部定殖穩(wěn)定性強(qiáng)，且不同接種濃度對(duì)內(nèi)部定殖的終菌量無顯著性影響。由此推知，低濃度的內(nèi)部定殖也能較好地應(yīng)用于田間的生物防治。

2.4 病原菌對(duì)生防菌定殖的影響

2.4.1 對(duì)山茶葉片表面定殖的影響 圖3表明，接種病原菌后山茶葉片表面的生防菌濃度發(fā)生明顯變化，特別是在拆袋第8天后，各處理生防菌量急劇減少；不接種病原菌的對(duì)照處理在拆袋40 d時(shí)的定殖量為3.2×105CFU/mL，另外3組處理在40 d時(shí)的定殖量均較低，為0.948×103～1.214×103CFU/mL。先施病原菌和先施生防菌的2組處理，前期與對(duì)照的定殖量相似，但后期其定殖量急劇下降，最終遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照；同時(shí)施用病原菌和生防菌的處理組，定殖量下降速度很快，其最終生防菌濃度與前2組處理幾乎一致。

圖3 茶褐斑擬盤多毛孢菌對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉表面定殖的影響
-◆-.PB(先施生防菌)；-■-.P+B(同時(shí)施用生防菌和病原菌)；-▲-.BP(先施病原菌)；-×-.CK(只施生防菌)
Fig.3 Effects ofPestalotipsisguepinion colonization ofBacillusamyloliquefacienson camellia leaves
-◆-.PB(Biocontrol strains first);-■-.P+B(Biocontrol strains and pathogens together);-▲-.BP(Pathogens first);-×-.CK(Biocontrol strains only)

圖4 茶褐斑擬盤多毛孢菌對(duì)解淀粉芽孢桿菌在山茶葉片內(nèi)部定殖的影響
-◆-.PB.(先施生防菌)；-■-.P+B(同時(shí)施生防菌和病原菌)；-▲-.BP(先施病原菌)；-×-.CK(只施生防菌)
Fig.4 Effects ofPestalotipsisguepinion colonization ofBacillusamyloliquefaciensin camellia leaves
-◆-.PB(Biocontrol strains first); -■-.P+B(Biocontrol strains and pathogens together);-▲-.BP(Pathogens first);-×-.CK(Biocontrol strains only)

2.4.2 對(duì)山茶葉內(nèi)定殖的影響 由圖4可知，定殖菌量在拆袋后第1～4 天內(nèi)濃度略有下降，后呈緩慢增長態(tài)勢(shì)，從第12天迅速上漲，于16 d時(shí)到達(dá)峰值，而后又呈下降態(tài)勢(shì)，并在20～28 d后基本趨于穩(wěn)定。最終4個(gè)處理的定殖量無顯著差異。病原菌幾乎對(duì)生防菌的葉內(nèi)定殖沒有影響，所有處理的變化趨勢(shì)均與對(duì)照相同。各處理的定殖濃度均略低于對(duì)照，但以同時(shí)施加茶褐斑擬盤多毛孢菌和解淀粉芽孢桿菌的處理組最低，其原因可能是在用微量進(jìn)樣器將生防菌注射到葉片內(nèi)部的過程中，引起了病原菌的小范圍入侵，改變了葉片內(nèi)部的微環(huán)境，從而對(duì)生防菌的定殖生長產(chǎn)生了抑制作用。

2.5 解淀粉芽孢桿菌對(duì)山茶灰斑病的防治效果

防治試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，生防菌解淀粉芽孢桿菌菌懸液對(duì)山茶灰斑病有顯著的生防效果。拆袋后5 d，防治效果略微下降，可能是拆袋后外部環(huán)境條件發(fā)生變化，抑制了解淀粉芽孢桿菌拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生，后期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，于15 d時(shí)達(dá)到最佳，最后逐漸趨于穩(wěn)定。從接種方式上看，滅菌葉組中預(yù)先接種解淀粉芽孢桿菌菌懸液處理的生防效果最好，防效達(dá)到75.35%，顯著高于另2種處理(P<0.05)；后噴施菌懸液處理組的防效也較好，防效達(dá)73.89%；解淀粉芽孢桿菌菌懸液和病原菌同時(shí)接種組的防效最低，但其防效也達(dá)到72.95%。關(guān)于葉片自身攜帶微生物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，由表1可知，葉片表面滅菌與否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果并無顯著影響。圖5～8 表明，解淀粉芽孢桿菌能夠有效地用于山茶灰斑病的田間生物防治，且防治效果較為顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究使用的解淀粉芽孢桿菌生防真菌是從山茶葉片內(nèi)部分離得到的1株內(nèi)生拮抗菌株，有關(guān)該菌株在山茶葉表面及內(nèi)部定殖能力的研究尚未見報(bào)道。Pinho等[19]認(rèn)為，內(nèi)生生防菌在植株上的穩(wěn)定定殖和拮抗強(qiáng)弱是其生防機(jī)制的先決條件；與此同時(shí)，許多學(xué)者指出，生防菌株在寄主植株的定殖位點(diǎn)是其生防效率高低的重要衡量因子[20-22]；高效、穩(wěn)定的標(biāo)記菌株是防病效果的前提保障。本研究采用抗生素標(biāo)記法[23]對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株進(jìn)行篩選，最終在含500 μg/mL鏈霉素抗性平板上得到突變菌株，且標(biāo)記菌株在形態(tài)特征、拮抗能力、防病效果方面均與未標(biāo)記菌株無明顯差異，這與冉淦僑等[24]的研究結(jié)果相似，故該標(biāo)記菌株能夠很好地應(yīng)用于山茶灰斑病的定殖研究，為山茶灰斑病的生防研究提供了重要的前提條件。

注：表中各數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值；差異性分析為同列比較，小寫英文字母表示在0.05水平上差異顯著(LSD 法)。

Note:All data are the average of three replicates.Difference analysis is in vertical comparison.Lowercase letters mean significant difference atP=0.05 level (LSD).

圖5 無菌水處理的山茶葉片F(xiàn)ig.5 Leaves of camellia treated with sterile water

圖6 病原菌處理的山茶葉片 Fig.6 Leaves of camellia treated with pathogens

圖7 預(yù)先接種解淀粉芽孢桿菌的山茶葉片
Fig.7 Leaves of camellia treated withBacillusamyloliquefaciensfirstly

圖8 同時(shí)接種病原菌和解淀粉芽孢桿菌的山茶葉片
Fig.8 Leaves of camellia treated withBacillusamyloliquefaciensand pathogens at the same time

目前，有關(guān)生防菌定殖的報(bào)道主要集中在土壤和植物根際方面，而在葉片表面和內(nèi)部定殖動(dòng)態(tài)的研究尚比較少[25]，研究中又以外部分離篩選得到的拮抗菌株居多，這類生防菌易受外界環(huán)境條件的影響，容易出現(xiàn)不能定殖或定殖后防病效果不穩(wěn)定等問題，而對(duì)于內(nèi)生生防菌定殖的報(bào)道甚少[26]。本研究表明，解淀粉芽孢桿菌在山茶葉片表面及葉片內(nèi)部均能夠高效定殖，且在葉片表面的定殖較葉片內(nèi)部更為高效、持久，其定殖量與接種濃度呈正相關(guān)，并可在一定時(shí)間內(nèi)維持相當(dāng)數(shù)量，這一結(jié)論充分證明解淀粉芽孢桿菌完全具備生防制劑菌株選擇的基本條件，將其以生防制劑的形式用于山茶灰斑病的防治，具有較高的理論性和實(shí)踐性，也使得山茶灰斑病的生物防治成為可能。

田間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，先噴施生防菌解淀粉芽孢桿菌菌懸液與同時(shí)噴施生防菌液和病原菌孢子懸液處理組的生防效果差異明顯，而后噴施解淀粉芽孢桿菌菌懸液處理組的生防效果也較好，可能是由于解淀粉芽孢桿菌具有較強(qiáng)的定殖競(jìng)爭作用，可以占領(lǐng)病原菌與寄主植株的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制病原菌的侵入，但對(duì)于其生防機(jī)制的確定還有待于進(jìn)一步研究。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌菌株在山茶灰斑病新型生防制劑的開發(fā)方面具有廣闊的前景，也為解決山茶灰斑病化學(xué)防治中的環(huán)境污染、誘導(dǎo)抗藥性、藥劑殘留等問題提供了新的思路。

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Colonization ofBacillusamyloliquefaciensin camellia leaves and its control efficacy against camellia gray spot

QIAO Tian-min,ZHANG Jing,RAN Xiao-xiao,ZHU Tian-hui

(CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】Bacillusamyloliquefaciensis one of the endogenous antagonistic strains separated from the internal camellia leaf.This study investigated the colonization ofB.amyloliquefaciensin camellia leaves and its control efficacy on against camellia gray spot to provide references for the development of new bio-control agents and biological control of camellia disease.【Method】 A mutant strain ofB.amyloliquefaciensresistant to streptomycin was screened and obtained with the antibiotic label method,and the contrast tests for morphological characteristics,antagonism abilities,and control effects were conducted.The colonization trials in camellia leaves with different inoculation concentrations and pathogens were determined with the spraying method and needle puncturing method.Field trials were also conducted.【Result】 The optimal marked strain was obtained from the resistant plating medium with streptomycin of 500 μg/mL.The morphological characteristics,antagonism abilities,and control effects of the marked strain were not significantly different from the unmarked strains.The colonization trials showed thatB.amyloliquefacienscould efficiently colonize on the surface and inside of camellia leaves.In addition,it colonized more efficient and durable on surface of leaves than the inside.The population of colonization was positively correlated with the inoculated concentration,and maintained considerable number at a certain time.The pathogen was related with the surface colonization,but not to inside colonization.The control tests in the field showed that biocontrol strain suspension had significant effect on camellia gray spot.The effect of inoculating pathogen after biocontrol strain was best with the rate of 75.35%.The effect of inoculating pathogen before biocontrol strain was 73.89%.The effect of inoculating biocontrol strain and the pathogen simultaneously was the lowest with rate of 72.95%.【Conclusion】 The bio-control strainB.amyloliquefacienscan effectively colonize in both the surface and inside of camellia leaves,and it possessed strong bi-control effects against camellia gray spot.

camellia gray spot;Bacillaceae;Pestalotiopsisguepini(Desm.)Stey;biological control;colonizing capacity

時(shí)間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.011

2014-03-10

國家自然科技資源共享平臺(tái)項(xiàng)目(2005DKA21207-13)

譙天敏(1972-)，女，四川南充人，副研究員，博士，主要從事林木病理學(xué)研究。E-mail:525636693@qq.com

朱天輝(1963-)，男，重慶開縣人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事林木病理學(xué)研究。E-mail:zhuth1227@126.com

S685.140.8

A

1671-9387(2015)10-0077-08

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