左佳妮，孫文聰，馮明星,胡兆農，吳文君

(西北農林科技大學 農藥研究所，陜西 楊凌 712100)

杠柳新苷T作用東方粘蟲幼蟲中腸細胞的免疫定位研究

左佳妮，孫文聰，馮明星,胡兆農，吳文君

(西北農林科技大學 農藥研究所，陜西 楊凌 712100)

【目的】 明確杠柳新苷T作用后在東方粘蟲幼蟲中腸腸壁細胞中的分布，探討其殺蟲作用機制?！痉椒ā?鑒于杠柳新苷T對東方粘蟲幼蟲具有明顯的胃毒活性，而對小地老虎幼蟲無殺蟲活性，采用膠體金免疫電鏡技術，比較觀察了杠柳新苷T處理的東方粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲中腸腸壁細胞的變化。【結果】 東方粘蟲幼蟲經(jīng)杠柳新苷T處理后，膠體金顆粒首先出現(xiàn)在微絨毛上，且密度隨著處理時間延長而逐漸增大，最終破壞微絨毛；同時，膠體金顆粒在細胞內的細胞器膜上也有出現(xiàn)，并損傷細胞器。小地老虎幼蟲經(jīng)杠柳新苷T處理后，中腸腸壁細胞及細胞器均沒有明顯變化，其上也沒有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒的存在?！窘Y論】 杠柳新苷T對東方粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲的選擇性與其在2種試蟲中腸腸壁細胞上的特異性結合存在顯著差異有關，杠柳新苷T作用東方粘蟲幼蟲后的初始結合部位可能是其中腸腸壁細胞，推測杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中腸腸壁細胞膜及細胞器膜上。

杠柳新苷T；東方粘蟲；小地老虎；中腸腸壁細胞；免疫定位

近年來，化學農藥大量使用導致的農藥毒害和生態(tài)環(huán)境持續(xù)破壞已經(jīng)引起全世界關注[1]，因此創(chuàng)制安全高效的“生物合理農藥”(biorational pesticides)或“環(huán)境相容性農藥”(environment compatible pesticides)，是符合科學發(fā)展觀的必由之路[2]。天然產(chǎn)物往往由于其結構新穎、活性獨特以及對環(huán)境安全等一系列優(yōu)點，成為當今世界新農藥創(chuàng)制的重要途徑，具有廣泛的應用前景[3]，如市面上已經(jīng)存在的印楝素、殺蟲劑Bt、核型多角體病毒(NPV)及抗菌素等[4]。

國內外已系統(tǒng)研究了杠柳(PeriplocasepiumBunge)的化學成分及其藥理學特性[5]。但在農用活性方面國內僅有杠柳相關粗提物活性的報道，如杠柳根皮的粗提液對小菜蛾幼蟲的活性主要表現(xiàn)為胃毒和拒食，而對菜青蟲幼蟲僅表現(xiàn)為拒食活性[6-7]；杠柳根皮的正丁醇粗提液對粘蟲幼蟲及麥二叉蚜具有毒殺作用[8]。

西北農林科技大學農藥研究所近10多年來對杠柳根皮的殺蟲活性成分及其致毒機理進行了比較系統(tǒng)的研究，分離得到一系列具有殺蟲活性的杠柳新苷類化合物[9-10]；該類化合物對小菜蛾、粘蟲和菜青蟲的幼蟲均表現(xiàn)為較強的胃毒作用，但對小地老虎無任何活性[11-12]。之后以對該類化合物不敏感的小地老虎幼蟲作為對照，研究了杠柳毒素對敏感的東方粘蟲幼蟲中腸腸壁細胞的影響，推測昆蟲中腸可能是其作用部位[13]，推斷該類化合物可能為一類新型的“昆蟲消化毒劑”。據(jù)此，以高殺蟲活性的化合物杠柳新苷T為抗原制備了其多克隆抗體[14]。

本研究利用膠體金免疫定位技術，以杠柳毒素T處理的小地老虎幼蟲中腸腸壁細胞為對照，對杠柳毒素T在東方粘蟲幼蟲中腸腸壁細胞內的分布進行免疫定位，旨在為進一步闡明杠柳毒素T對東方粘蟲幼蟲的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

小地老虎(Agrotisypsilon)、東方粘蟲(Mythimnaseparata)均由本實驗室養(yǎng)蟲室提供，室內人工飼養(yǎng)多代，挑選6齡粘蟲饑餓24 h后供試。

1.2 供試藥劑及主要儀器

杠柳新苷T(純度大于95%)，由本實驗室提供，用丙酮將其配成10 mg/mL供試。

LKBU型超薄切片機及JEM-22000EX 透射電子顯微鏡。

1.3 處理方法

以載毒葉碟法飼喂試蟲：在小麥葉片(0.5 cm×0.5 cm)上涂布1 μL 10 mg/mL供試藥劑，待溶劑揮發(fā)干后，將試蟲與葉片一起放入培養(yǎng)皿中，處理后5，8，10 h取樣，對照組試蟲以涂布1 μL丙酮的小麥葉片進行相同處理。

1.4 抗 體

一抗：鼠抗杠柳新苷T的多克隆抗體，由西北農林科技大學農藥研究所提供[14]，其稀釋倍數(shù)為1∶10。

二抗：15 nm膠體金標記羊抗鼠IgG，購自TED PELLA公司，其稀釋倍數(shù)為1∶20。

1.5 樣品制備及染色方法

(1)將對照及處理5，8，10 h后的試蟲，冰浴中迅速解剖中腸，用生理鹽水清洗除掉殘渣；(2)前固定用40 mL/L戊二醛，沉底后清洗用2.5%戊二醛；洗凈鋨酸，避光固定30～40 min，此步試驗在4 ℃下進行；(3)清除殘留固定液：0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖3次，5 min/次；(4)清除殘留PBS，1%的鋨酸固定40～50 min；(5)清除固定液：0.1 mol/L PBS沖3次，10 min/次；(6)梯度脫水：體積分數(shù)30%，50%，70%，80%，90%(2次)及100%(3次)丙酮，10 min/次；(7)脫水后，用1∶1的滲透液(純Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑與100%丙酮)滲透2 h；接著2∶1的滲透液(純包埋劑與100% 丙酮)滲透2 h；最后在純包埋劑中輕微搖動過夜；(8)滲透后，將其定向包埋在包埋模具中，在37 ℃、45 ℃和60 ℃的溫箱中分別聚合16 h、24 h和48 h；(9)用超薄切片機切片，并放于鎳網(wǎng)上；(10)將鎳網(wǎng)切片進行1 h封閉(1%明膠及1%BSA)；(11)將其孵育在第一抗體上(1∶10，一抗稀釋液稀釋)，在室溫下孵育2 h；(12)3次BSA洗滌，2次PBS洗滌(10 min/次)；(13)孵育1 h：切片與稀釋的膠體金標記的羊抗鼠二抗(用PBS 1∶20稀釋)；(14)3次二抗稀釋液清洗，10 min/次；(15)2次雙蒸水清洗，10 min/次，晾干；(16)染色8 min(醋酸雙氧鈾)；(17)染色5 min(檸檬酸鉛)；(18)用透射電鏡觀察并拍照。 對照組處理方法：第11步用1% BSA替換一抗與鎳網(wǎng)切片進行孵育；其他步驟同處理組。對照組和處理組在相同批次下進行。

2 結果與分析

2.1 杠柳新苷T作用東方粘蟲的免疫定位

杠柳新苷T處理東方粘蟲5 h后，在微絨毛上分布著極少量的膠體金顆粒，中腸細胞內細胞質密度下降和內質網(wǎng)擴張；處理后8 h，微絨毛上膠體金顆粒的數(shù)量增多，細胞內部也可看到少量膠體金顆粒的分布，中腸腸壁細胞可見到線粒體腫脹，個別線粒體的內脊和雙層膜變得模糊；處理后10 h，大量的膠體金顆粒出現(xiàn)在細胞的微絨毛上及細胞內部，大部分細胞器也受到嚴重損傷。從處理時間來看，隨著處理時間的延長，膠體金顆粒出現(xiàn)得越來越多，范圍也越來越廣，并且大部分存在于粘蟲中腸腸壁細胞膜上。而對照組粘蟲幼蟲的中腸細胞膜系統(tǒng)上及細胞內部均沒有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒，中腸細胞也沒有明顯的病變(圖1)。

圖1 杠柳新苷T對東方粘蟲中腸腸壁細胞超微結構的影響A.對照微絨毛(10 000×)；B.處理5 h微絨毛(40 000×)；C.處理8 h微絨毛(40 000×)；D.處理10 h微絨毛(40 000×)；E.對照線粒體(80 000×)； F.處理5 h線粒體(40 000×)；G.處理8 h線粒體(40 000×)；H.處理10 h線粒體(40 000×)；I.對照內質網(wǎng)(40 000×)；J.處理5 h內質網(wǎng)(40 000×)；K.處理8 h內質網(wǎng)(40 000×)；L.處理10 h內質網(wǎng)(40 000×)；MV.微絨毛；M.線粒體；ER.內質網(wǎng)；CG.膠體金顆粒

2.2 杠柳新苷T作用小地老虎的免疫定位

經(jīng)杠柳新苷T處理5，8，10 h后，小地老虎幼蟲的中腸細胞處理組和對照組均沒有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒的存在，中腸腸壁細胞及細胞器均無明顯病變(圖2)。結果說明，小地老虎幼蟲中腸腸壁細胞上沒有結合杠柳新苷T。

圖2 杠柳新苷T對東方小地老虎中腸腸壁細胞超微結構的影響 A.對照微絨毛(10 000×)；B.處理5 h微絨毛(40 000×)；C.處理8 h微絨毛(40 000×)；D.處理10 h微絨毛(40 000×)；E.對照線粒體(80 000×)；F.處理5 h線粒體(40 000×)；G.處理8 h線粒體(40 000×)；H.處理10 h線粒體(40 000×)；I.對照內質網(wǎng)(40 000×)；J.處理5 h內質網(wǎng)(40 000×)；K.處理8 h內質網(wǎng)(40 000×)；L.處理10 h內質網(wǎng)(40 000×)；MV.微絨毛；M.線粒體；ER.內質網(wǎng)；CG.膠體金顆粒

3 討 論

免疫膠體金技術(IGG)具有靈敏度高和分辨力強等優(yōu)點[15]。本研究首先利用杠柳毒素T的多克隆抗體及其蛋白容易標記的特性對杠柳新苷T進行了間接性的標記，同時，采用IGG方法與杠柳毒素T進行了體內結合，結果表明杠柳新苷T主要在粘蟲幼蟲中腸腸壁細胞膜系統(tǒng)(細胞膜和細胞器膜)上有結合；另外，對細胞的結構本身也造成了相當大的損傷。此前杠柳毒素NW對粘蟲中腸作用的超微結構和熒光定位研究表明，杠柳毒素NW對粘蟲中腸細胞膜及其細胞器膜的破壞是其主要的致毒機制，并推斷昆蟲中腸腸壁細胞膜可能是杠柳毒素NW的結合位點[13]。本研究在初步證實上述推測的可靠性以外，還進一步明確了杠柳毒素能夠與東方粘蟲中腸腸壁細胞的細胞膜及細胞器膜結合，這些膜系統(tǒng)上可能存在其結合的特異性蛋白。

免疫電鏡組織定位技術在研究中最常用的方法有2種，一是采用不同大小的膠體金顆粒作標記的包埋后雙重標記法；另一種是包埋前免疫電鏡染色法與包埋后膠體金標記法相結合的雙重標記法[16-17]。本研究借鑒了苦皮藤素V免疫電鏡組織定位中采用的方法[18]，結果表明杠柳新苷T在細胞內部也可以結合，分析可能原因為，一是杠柳毒素T與粘蟲中腸細胞膜上的結合蛋白可以特異結合，通過特殊的離子通道進入到細胞的內部；二是杠柳新苷T與粘蟲中腸細胞膜上的結合蛋白結合后，直接導致中腸細胞膜破裂，打破了中腸內外的離子平衡。但是，具體的作用機制目前還不清楚。

“消化毒劑”的概念自1997年提出[19]后，已經(jīng)有不少關于消化毒劑的報道，消化毒劑的致毒機理最可能是,其對試蟲中腸細胞膜和內膜系統(tǒng)具有破壞作用。采用免疫電鏡組織定位技術發(fā)現(xiàn)，苦皮藤素V在中毒粘蟲的中腸上皮細胞上有結合[18]，動物源殺蟲活性物質斑蝥素對粘蟲消化系統(tǒng)起作用主要是導致了粘蟲中腸細胞膜和內膜系統(tǒng)的破壞[20]。本研究結果表明，杠柳毒素的作用位點位于試蟲中腸細胞膜及其內膜系統(tǒng)上。盡管這些研究表明，消化毒劑的作用位點位于試蟲中腸細胞膜及其內膜系統(tǒng)上，但是它們與中腸細胞膜特異性結合以及其與膜的結合位點仍不清楚，因此，對于杠柳毒素T在膜上的結合位點或者其在試蟲中腸上的作用靶標仍待進一步研究。

4 結 論

杠柳新苷T對東方粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲的選擇性與其在2種試蟲中腸腸壁細胞上的特異性結合存在顯著差異有關，杠柳新苷T作用東方粘蟲幼蟲后的初始結合部位可能是其中腸腸壁細胞，推測杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中腸腸壁細胞膜及細胞器膜上。

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Immunolocalization of periplocoside T fromPeriplocasepiumBunge in larvae midgut of oriental amyworm,MythimnaseparataWalker (Lepidoptera:Noctuidae)

ZUO Jia-ni,SUN Wen-cong,FENG Ming-xing,HU Zhao-nong,WU Wen-jun

(PesticideResearchInstitute,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The objective of this research was to figure out the distribution of periplocoside T (PST) in midgut cell ofMythimnaseparatalarvae after treatment by PST and explore its action mechanism.【Method】 Since PST has stomach toxicity toM.separatalarvae while has no activity toAgrotisypsilonlarvae,the changes of midgut wall cells of these two insects after treatment with PST were observed comparatively using immune-electron microscopy (TEM).【Result】 After treatment with PST,gold particles appeared on the microvilli layer of the midgut ofM.separatalarvae firstly.The density of gold particles gradually increased and destructed microvilli layer severely at last.Meantime,gold particles also appeared on the intracellular organelles membrane and the organelles were also destructed.For the control ofA.ypsilonlarvae,there was no effect and no gold particle appeared.【Conclusion】 The selectivity of PST to these insects was related to the significant difference of its special binding with these two insects.The midgut intestinal wall cells may be the original binding site of PST.It was speculated that the target protein of PST may exist on cell membranes and organelles membranes.

periplocoside T (PST);Mythimnaseparata;Agrotisypsilon;midgut cells;immuno-localization

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.017

2014-03-28

國家自然科學基金項目(31171868);國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(200903052)

左佳妮(1990-),女,甘肅慶陽人,碩士,主要從事昆蟲毒理學研究。E-mail:zoey@nwsuaf.edu.cn

胡兆農(1970-),男,甘肅臨夏人,教授,博士生導師,主要從事天然產(chǎn)物農藥和昆蟲毒理學研究。 E-mail:huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

S432.2

A

1671-9387(2015)11-0118-05

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.034.html