吳景龍，隋丹丹，張冬輝，周智敏，李 昊，鄭雪莉，韓崇選

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

草兔卵透明帶3(ZP3)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

吳景龍，隋丹丹，張冬輝，周智敏，李 昊，鄭雪莉，韓崇選

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 利用基因重組技術(shù)將草兔卵透明帶3基因(ZP3)構(gòu)建到真核表達(dá)載體上，并在RK-13細(xì)胞中表達(dá)ZP3蛋白，為后期的免疫不育研究提供方便?！痉椒ā?提取草兔卵巢總RNA，采用RT-PCR方法克隆ZP3基因，將其與pEGFP-N1真核表達(dá)載體連接，構(gòu)建pEGFP-N1-ZP3表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)入RK-13細(xì)胞中進(jìn)行ZP3表達(dá)。利用倒置熒光顯微鏡、RT-PCR和Western Bolt方法對(duì)重組ZP3蛋白表達(dá)情況進(jìn)行觀測(cè)?！窘Y(jié)果】 RT-PCR獲得長為1 260 bp的草兔ZP3基因；成功構(gòu)建pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞后表達(dá)出73 ku的重組ZP3蛋白，RT-PCR驗(yàn)證和Western Bolt結(jié)果與ZP3基因的理論長度一致?！窘Y(jié)論】 首次構(gòu)建了草兔ZP3基因真核表達(dá)載體并成功在真核細(xì)胞中表達(dá)重組ZP3蛋白。

草兔；卵透明帶3基因；免疫不育；pEGFP-N1；真核表達(dá)

草兔(Lepuscapensis)屬兔形目(Lagomorpha)兔科(Leporidae)，與穴兔屬(Oryctolagus)的歐洲兔以及新西蘭大白兔不同，屬山兔屬(Lepus)[1]，分布縱跨亞洲、歐洲和非洲，是一類適應(yīng)性很強(qiáng)的哺乳動(dòng)物[2]。在我國，從海拔5 000 m以上的西北青藏高原到東部沿海平原，從東北寒冷的大興安嶺地區(qū)到最南端熱帶地區(qū)的海南島都有草兔的分布，甚至在極度干旱的戈壁和沙漠邊緣也有它們的活動(dòng)蹤跡。近年來由于人為原因及自然災(zāi)害等因素的影響，草兔的活動(dòng)更加猖獗，給我國的林業(yè)、農(nóng)業(yè)和牧業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的損失[3]。然而現(xiàn)在的防治方法還停留在以控制死亡率為目的的傳統(tǒng)方法上，如機(jī)械捕殺、化學(xué)毒殺等，雖然這些方法短時(shí)間內(nèi)對(duì)于控制有害生物起到了顯著的效果，但是這些方法普遍存在工作量大、成本高、專一性差、滅效短、種群恢復(fù)快等缺點(diǎn)，而且化學(xué)毒殺方法對(duì)環(huán)境的污染及公眾的安全危害較大。隨著公眾對(duì)環(huán)保和動(dòng)物權(quán)益等方面意識(shí)的增強(qiáng)，許多國家開始轉(zhuǎn)變有害生物防治的策略，通過減少出生率來控制其數(shù)量。應(yīng)運(yùn)而生的免疫不育技術(shù)顯示出了相當(dāng)誘人的前景，其一方面使種群內(nèi)部分個(gè)體不能繁育，降低種群的出生率，另一方面不育個(gè)體存在繼續(xù)占用空間、消耗資源等競爭性繁殖干擾，保持緊張的社群壓力，從而抑制種群數(shù)量的恢復(fù)和發(fā)展。針對(duì)像鼠兔類這樣的生長發(fā)育快、性成熟早、妊娠期短、分娩后可立即發(fā)情交配、全年大部分時(shí)間都能繁殖且單胎仔數(shù)多的有害生物，免疫不育技術(shù)的防治效果很好。目前免疫不育已經(jīng)成為國際上最有潛力的種群控制技術(shù)[4]。

免疫不育技術(shù)是利用基因重組等分子生物學(xué)技術(shù)將草兔生育調(diào)控激素或相關(guān)蛋白與具有免疫活性的“碎片”或其他外源性大分子物質(zhì)連接起來形成抗原，使機(jī)體產(chǎn)生破壞自身生殖的抗體，達(dá)到阻斷生育的目的。由于免疫不育的抗原自身具有種的特異性，如果再加上專一性強(qiáng)的病原微生物攜帶和傳播[5-6]，不僅解決了疫苗傳遞的問題，降低成本，提高防治效率，而且對(duì)防治對(duì)象的專一性有了“雙保險(xiǎn)”的作用。通過免疫途徑使動(dòng)物不育，最關(guān)鍵的是選擇免疫不育疫苗，目前避孕疫苗抗原研究主要集中在激素抗原、精子抗原和卵透明帶這3類靶抗原上。其中哺乳動(dòng)物卵透明帶(Zona pellucida，ZP)是由卵母細(xì)胞合成和分泌并包裹在其外部的一層糖蛋白基質(zhì)，由3～4種蛋白組成，分別稱為ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[7-8]，是精卵結(jié)合的特異性識(shí)別媒介，是精子的最初受體，對(duì)卵子生成、精卵結(jié)合和早期胚胎發(fā)育具有重要作用[9]。大量研究表明，ZP3蛋白能以抗原的形式干擾精子與正常ZP3的結(jié)合而阻斷小鼠、豬、猴子等的生殖過程[10-11]。同時(shí)有研究表明，各物種ZP3的羧基端及糖支鏈特異性抗原表位相對(duì)應(yīng)的區(qū)域同源性極低，即使在小鼠和倉鼠之間也不例外，而且ZP3蛋白是卵巢特有的，在其他組織中不表達(dá)，不會(huì)離開卵巢進(jìn)入血液循環(huán)，不會(huì)形成復(fù)雜的免疫復(fù)合體以及與其他組織發(fā)生交叉反應(yīng)或引起激素水平上的紊亂，因此ZP3蛋白在免疫過程中有很高的種屬特異性和組織特異性，是一種很有前途的抗生育疫苗。

有研究證實(shí)，ZP3蛋白在哺乳動(dòng)物中能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，具有顯著的抗生育作用，利用ZP3蛋白免疫能大大降低動(dòng)物的受精率。目前已有人[12]、小鼠[13]、狗[7,14]、草原兔尾鼠(Laguruslagurus)[15-16]、歐洲兔(Oryctolaguscuniculus)[17]、帽猴(Macacaradiata)[18-20]、狒狒(Papioanubis)[21]、鯉魚[22]、考拉(Phascolarctoscinereus)[23]和刷尾負(fù)鼠(Trichosurusvulpecula)[24-25]等多種哺乳動(dòng)物的卵透明帶蛋白成功在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并用于免疫不育的研究，但有關(guān)草兔ZP3蛋白的免疫效果卻未見報(bào)道。本研究對(duì)草兔ZP3基因進(jìn)行了克隆，構(gòu)建其增強(qiáng)型綠色熒光蛋白pEGFP-N1-ZP3真核表達(dá)載體，并對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)，旨在為進(jìn)一步深入研究草兔免疫不育疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 草兔捕自陜北黃土高原地區(qū)，雌性，體長30 cm左右。

1.1.2 試 劑 RNAout提取試劑盒，購自上海生工；RQ1 RNase-Free DNase，購自Promega公司；高效瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及去內(nèi)毒素大提試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，購自Fermentas公司；連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1、QuickCutXhoⅠ/EcoRⅠ，購自TaKaRa(大連)生物有限公司；南美胎牛血清(FBS)、DMEM、100×青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶溶液及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent，購自Thermo公司；Opti-MEM，購自Gbico公司；2×TaqMasterMix、DNA Marker、抗His標(biāo)簽鼠單抗、抗GFP標(biāo)簽鼠單抗、抗GAPDH內(nèi)參鼠單抗，二抗Goat Anti-Mouse IgG及eECL Western Blot高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 克隆載體T-Vector pMD19 (Simple)購自TaKaRa(大連)生物有限公司；真核表達(dá)載體pEGFP-N1由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張成成博士饋贈(zèng)；大腸桿菌克隆菌株DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔腎臟細(xì)胞(RK-13)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 草兔卵巢總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將剛捕獲的草兔從籠中提起，用木槌等硬物用力敲擊其后腦處處死，整個(gè)過程應(yīng)做好防護(hù)，避免因草兔掙扎而受傷。待確認(rèn)草兔已死亡后，將其腹面朝上固定于解剖臺(tái)上，解剖取出卵巢組織，液氮中保存待用。取2只兔子的卵巢于液氮中快速研磨，按照RNAout試劑盒說明提取總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其總RNA濃度及質(zhì)量，1.2%瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測(cè)，如果有DNA殘留，用無RNA酶的DNA酶試劑盒進(jìn)行消化，然后用First-Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 草兔ZP3全長cDNA的克隆及測(cè)序

根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林鼠、兔害防治實(shí)驗(yàn)室在GenBank上登錄的ZP3基因開放閱讀框序列(GenBank登錄號(hào)：KC447289.1)[26]設(shè)計(jì)全長引物，上游引物(F1)：5′-ATGGGGCTGAGCTACGGG-3′，下游引物(R1)：5′-TTATTGGGAAGCAGACCTGG-3′，委托上海生工合成。

以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL，引物F1、R1終濃度均為0.5 μmol/L，模板cDNA 30 ng，ddH2O 補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；最后72 ℃終止補(bǔ)償延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將回收的產(chǎn)物目標(biāo)片段亞克隆于T-Vector pMD19 (Simple)載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)、24 μg/mL IPTG和20 μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上過夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。次日挑取白色單克隆搖管培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的克隆菌液寄往上海生工，用T-Vector pMD19 (Simple)載體通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用MEGA 5.0軟件進(jìn)行拼接并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

1.4 pEGFP-N1-ZP3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 真核表達(dá)目的基因ZP3引物的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)兩端分別帶有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的草兔ZP3全長引物，上游引物(F2)：5′-CCGCTCGAGATGGGGCTGAGCTACGGGCTC-3′，下游引物(R2)：5′-CCGGAATTCCTTGGGAAGCAGACCTGGGGTG-3′，其中上游引物(F2)包含一個(gè)起始密碼子(ATG)方便蛋白轉(zhuǎn)錄起始(下劃線標(biāo)注為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物(R2)已去掉ZP3終止密碼子(TAA)以利于其與后邊相連的GFP融合表達(dá)(下劃線標(biāo)注為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。引物委托上海生工合成。

1.4.2 真核表達(dá)目的基因ZP3的獲得 以1.3中構(gòu)建并驗(yàn)證正確的pMD-19T-ZP3克隆為模板，F(xiàn)2和R2為引物，菌液PCR(PCR體系及程序同1.3)獲得帶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因ZP3。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收，回收DNA用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及質(zhì)量，同時(shí)用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測(cè)。

1.4.3 真核表達(dá)載體pEGFP-N1的獲得 提前1 d用試管培養(yǎng)適量的帶pEGFP-N1質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌菌株，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pEGFP-N1質(zhì)粒，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及質(zhì)量，同時(shí)用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測(cè)。

1.4.4 真核表達(dá)載體pEGFP-N1和目的基因ZP3的酶切、連接及轉(zhuǎn)化 將1.4.2得到的ZP3基因和1.4.3得到的pEGFP-N1質(zhì)粒均用XhoⅠ和EcoRⅠ QuickCut限制酶37 ℃酶切1 h。用凝膠回收試劑盒分別回收已酶切的ZP3目的基因片段和pEGFP-N1載體片段，2個(gè)片段用DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株。為提高構(gòu)建成功率，在將2個(gè)片段混合之后65 ℃熱激4 min，迅速冰浴2 min，然后再加SolutionⅠ過夜連接，同時(shí)在轉(zhuǎn)化之前加1 μL轉(zhuǎn)化增強(qiáng)劑Solution Ⅲ(DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒中包含SolutionⅠ和Solution Ⅲ)。

1.4.5 pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 將所得pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子涂布于含50 μg/mL硫酸卡那霉素(Kana)的LB平板上過夜篩選培養(yǎng)，次日挑取單菌落搖菌，菌液PCR驗(yàn)證，同時(shí)提取pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒分別進(jìn)行XhoⅠ、EcoRⅠ單酶切及XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證。

將上述菌液PCR驗(yàn)證和單/雙酶切驗(yàn)證均正確的單克隆菌液寄至上海生工，用pEGFP-N1載體通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用MEGA 5.0軟件進(jìn)行拼接并比對(duì)驗(yàn)證。

1.5 pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的大量制備

將驗(yàn)證正確的pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒菌株接種于200 mL LB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，超微量紫外分光光度計(jì)及凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RK-13細(xì)胞培養(yǎng)及pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

1.6.1 RK-13細(xì)胞的培養(yǎng) RK-13細(xì)胞培養(yǎng)用含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃。細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換1次，2～3 d傳代1次。

1.6.2 RK-13轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備 將生長狀態(tài)良好的RK-13細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化，新鮮培養(yǎng)基重懸，取適量細(xì)胞懸液臺(tái)盼藍(lán)染色，在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔約5×104個(gè)細(xì)胞的接種量接種于24孔板中，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。

1.6.3 pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 當(dāng)24孔板中的細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)棄去舊培養(yǎng)基，更換新的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時(shí)每孔重組質(zhì)粒用量1 μg。具體操作如下：取1 μg pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒，用100 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，加入2 μL的TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，移液槍吹打混勻，室溫孵育17 min后逐滴加入上述24孔板中，輕輕搖勻，37 ℃繼續(xù)孵育。12 h后換液，期間如果觀察到細(xì)胞狀態(tài)不佳應(yīng)及時(shí)換液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)情況。在轉(zhuǎn)染時(shí)同時(shí)設(shè)置空白R(shí)K-13細(xì)胞及pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞對(duì)照組。

1.7 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的RK-13細(xì)胞中ZP3基因的RT-PCR檢測(cè)

用RNAout試劑盒分別提取轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3或pEGFP-N1載體的RK-13細(xì)胞及空白R(shí)K-13細(xì)胞的總RNA，以提取的總RNA為模板， F2和R2為引物，按照One Step RT-PCR Kit操作手冊(cè)，RT-PCR法分別檢測(cè)這3種RK-13細(xì)胞中目的基因ZP3的表達(dá)情況。

1.8 ZP3在RK-13細(xì)胞中的大量表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

將RK-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系按比例放大到60 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染表達(dá)，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，細(xì)胞裂解液裂解后收集蛋白，取適量樣品用蛋白定量試劑盒定量后加蛋白loading buffer，沸水浴10 min，14 000 r/min離心10 min收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述已處理樣品適量，用8%分離膠的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉2 h，封閉完將膜從預(yù)染蛋白Marker 45 ku左右的位置剪開一分為二，蛋白分子質(zhì)量大的一塊膜封于含5 mL抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體(1∶700稀釋)的雜交小袋中，另外一塊封于裝抗GAPDH的鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)雜交小袋中，4 ℃孵育過夜。次日分別用TBST洗膜，洗完后將2塊膜一起放入HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)中室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草兔ZP3基因的克隆

提取的總RNA電泳結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280為1.98，RNA含量為213.54 ng/μL；PCR擴(kuò)增得到長度約為1 250 bp的條帶(圖1)，與理論值相符；測(cè)序結(jié)果顯示其長度為1 260 bp，無堿基缺失及突變。

圖1 草兔ZP3基因的克隆

2.2 草兔pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的鑒定

從1.4.5轉(zhuǎn)化的瓊脂糖平板上挑取8個(gè)pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液PCR檢測(cè)獲得了約1 250 bp的條帶(圖2)，條帶長度與理論值一致。選取其中4個(gè)克隆提取質(zhì)粒，XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后得到1 250 bp的pEGFP-N1-ZP3目的基因片段和4.7 kb的載體片段；XhoⅠ、EcoRⅠ單酶切均獲得1條線性重組質(zhì)粒條帶，大小比雙酶切的線性載體條帶稍大；而重組質(zhì)粒由于是超螺旋結(jié)構(gòu)，電泳速度比線性質(zhì)粒稍快，因此顯示比單酶切的條帶稍小一些(圖3泳道1)。測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒ZP3基因長度及序列與理論值一致。

圖2 草兔真核表達(dá)載體pEGFP-N1-ZP3的菌液PCR檢測(cè)

2.3 草兔ZP3在RK-13細(xì)胞中表達(dá)的熒光觀察

RK-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染pEGFP-N1(圖4-A)和pEGFP-N1-ZP3(圖4-D)的RK-13細(xì)胞均有綠色熒光，多為明亮的綠色熒光，少數(shù)發(fā)出弱熒光；與眀場(chǎng)中的RK-13細(xì)胞(圖4-C)相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的細(xì)胞約75%成功表達(dá)；空白R(shí)K-13細(xì)胞對(duì)照無表達(dá)，未見綠色熒光(圖4-B)。

圖3 草兔真核表達(dá)載體pEGFP-N1-ZP3的單雙酶切鑒定M．DNA Marker；1.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ZP3；2.重組質(zhì)粒XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切；3.重組質(zhì)粒XhoⅠ單酶切；4.重組質(zhì)粒EcoRⅠ單酶切

圖4 草兔ZP3-GFP融合蛋白在RK-13細(xì)胞中表達(dá)的熒光顯微鏡觀察(48 h)A.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的RK-13細(xì)胞(暗場(chǎng)激光激發(fā))；B.空白R(shí)K-13細(xì)胞(暗場(chǎng)激光激發(fā))；C.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞(明場(chǎng))；D.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞(暗場(chǎng)激光激發(fā))
Fig.4 Analysis of ZP3-GFP expression in RK-13 cells after 48 hours with fluorescence microscopy A.RK-13 cells transfected with pEGFP-N1 as control;B.RK-13 cells without being transfected as control;C.Expression of pEGFP-N1-ZP3 cells in bright field;D.Expression of pEGFP-N1-ZP3 cells with green fluorescence

2.4 草兔ZP3在RK-13細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 250 bp處有一清晰條帶(圖5)，與ZP3基因理論長度相符，說明ZP3基因轉(zhuǎn)入RK-13細(xì)胞中并成功轉(zhuǎn)錄。

2.5 草兔ZP3-GFP重組蛋白的Western Blot檢測(cè)

RK-13表達(dá)細(xì)胞的裂解液上清經(jīng)SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，與抗GFP的一抗反應(yīng)后在約73 ku處有一條陽性反應(yīng)條帶，與理論大小一致，而空細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體細(xì)胞沒有陽性條帶(圖6-A)，表明ZP3-GFP融合蛋白在RK-13細(xì)胞中成功表達(dá)。GAPDH內(nèi)參條帶亮度基本一致(圖6-B)，從側(cè)面說明3個(gè)處理組上樣量一致。

圖5 轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞中草兔ZP3基因的RT-PCR檢測(cè)M．DNA Marker；1.轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的RK-13細(xì)胞；3.未轉(zhuǎn)染的空白R(shí)K-13細(xì)胞Fig.5 Analysis of expression products of ZP3 in RK-13 cells by RT-PCR M.DNA Marker;1.RK-13 cells transfected by pEGFP-N1-ZP3;2.RK-13 cells transfected by pEGFP-N1 as control;3.RK-13 cells without being transfected as control

圖6 草兔ZP3-GFP重組蛋白的Western Blot分析 A.一抗為抗GFP的鼠單克隆抗體；B.內(nèi)參基因GAPDH(為保證上樣量一致)，一抗為抗GAPDH的鼠單克隆抗體 1.空白R(shí)K-13細(xì)胞對(duì)照；2.轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的RK-13細(xì)胞；3.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞Fig.6 Analysis of expression products of ZP3-GFP in RK-13 cells by Western Blot A.Anti-GFP Western Blot;B.Anti-GAPDH Western Blot to equalize the quantity of loading protein;1.RK-13 cells transfected without being transfected as control;2.The cells transfected with pEGFP-N1;3.The cells transfected with pEGP-N1-ZP3

3 討論與結(jié)論

ZP3免疫不育研究最多的是豬ZP3蛋白，印度新德里國家免疫學(xué)中心配子抗原實(shí)驗(yàn)室曾用豬的ZP3α蛋白輔以弗氏完全佐劑免疫帽猴，成功使其不育，但當(dāng)抗體滴度下降時(shí)，大約有一半的猴子又重新獲得了妊娠能力[27-28]。用ZP3免疫在降低受精率的同時(shí)伴隨有部分動(dòng)物自身免疫卵巢炎反應(yīng)，卵巢結(jié)構(gòu)遭受不同程度的破壞，卵泡的發(fā)育也受到影響[29-31]。但有害生物防治不同于人類避孕研究，不需要考慮避孕的可逆性，以及免疫動(dòng)物是否患有卵巢炎及生殖系統(tǒng)被破壞等問題，只要能提高免疫不育的成功率和持久性就行[32]。

目前迫切要解決的問題是要從ZP3蛋白序列中選擇一段能夠產(chǎn)生免疫不育的蛋白表位片段。研究表明，ZP3蛋白非常保守，其家族成員在結(jié)構(gòu)上都有位于N端的22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列、位于尾部C端弗林蛋白酶的切割位點(diǎn)和跨膜區(qū)，以及中間大約260個(gè)氨基酸的保守序列[33]。有數(shù)據(jù)顯示，人的ZP3蛋白氨基酸序列與小鼠有67%的相似度，與兔子有69%相似，與豬有74%相似，與帽猴的相似度甚至達(dá)到93.9%[34]，并且這些物種之間大多都存在交叉免疫反應(yīng)，用他們的ZP3來免疫異種動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)免疫反應(yīng)[29,35-36]，因此本試驗(yàn)選擇的免疫表位片段不僅要包括ZP3特性的保守區(qū)域，還要帶有草兔特異性的識(shí)別區(qū)域，以保證免疫靶動(dòng)物的準(zhǔn)確性。資料顯示，關(guān)于ZP3的研究大多都集中在其去信號(hào)肽和去跨膜區(qū)的保守片段與此片段在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其免疫原性上。本研究前期曾嘗試?yán)胮ET-28a(+)載體在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)，試驗(yàn)經(jīng)過2個(gè)階段：第1階段是以去掉前端信號(hào)肽的ZP3為目的基因插入pET-28a(+)載體與His標(biāo)簽融合表達(dá)[37]，但可能是后端疏水的跨膜區(qū)影響，ZP3融合蛋白表達(dá)量不高；因此第2階段同時(shí)去掉了信號(hào)肽和跨膜區(qū)區(qū)域，只留核心片段，表達(dá)量有所提高，但蛋白以包涵體的形式存在，不利于后期的純化和免疫。有關(guān)ZP3蛋白免疫原性的研究表明，ZP3蛋白在表達(dá)過程中有很多后期的N-和O-鏈接糖支鏈修飾，其是精子識(shí)別和結(jié)合的重要抗原決定簇位點(diǎn)，起著關(guān)鍵性的作用[38]。但原核表達(dá)系統(tǒng)由于沒有復(fù)雜的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和信號(hào)調(diào)控，并且目標(biāo)蛋白前段的幫助轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的信號(hào)肽序列也被去掉，因此目標(biāo)蛋白在表達(dá)過程中不存在后期的甲基化和糖基化等修飾，以及二硫鍵和多肽折疊高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。故原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來的蛋白與天然蛋白相差甚遠(yuǎn)，更談不上其免疫原性和特異性。

鑒于前期的探索性試驗(yàn)，本研究選擇用哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)ZP3蛋白。相對(duì)于其他表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)具有更準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子，表達(dá)蛋白可以分泌到細(xì)胞外部便于下游產(chǎn)物分離純化，且外源基因可以整合表達(dá)，穩(wěn)定遺傳。在本試驗(yàn)中，表達(dá)載體采用pEGFP-N1穿梭質(zhì)粒，其含有一個(gè)編碼GFP的基因片段，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效融合表達(dá)，方便檢測(cè)。綠色熒光蛋白編碼序列的上游有巨細(xì)胞病毒的早期啟動(dòng)子序列和Kozak序列，可促進(jìn)外源基因的表達(dá)起始。多克隆位點(diǎn)可供外源基因片段插入，而外源基因片段無終止密碼，且基因讀碼框架與GFP基因讀碼框架一致，可與GFP蛋白融合表達(dá)。表達(dá)ZP3的宿主細(xì)胞則選用分類上與草兔更接近的兔源RK-13細(xì)胞。

在重組蛋白的轉(zhuǎn)染表達(dá)過程中，雖然蛋白得到成功表達(dá)，但是筆者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染過程中重組質(zhì)粒的質(zhì)量及其與轉(zhuǎn)染試劑的比例非常重要。本試驗(yàn)中，分別采用普通的質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒素試劑盒來提取轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒，其中普通試劑盒試驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染表達(dá)后期細(xì)胞死亡很多，細(xì)胞狀態(tài)很差，而去內(nèi)毒素試劑盒組的細(xì)胞相對(duì)前者好很多。同時(shí)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的量太低轉(zhuǎn)染效率不高，太高則影響細(xì)胞的生長；兩者之間比例不同，轉(zhuǎn)染效率也不同。因此在采用不同的表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)優(yōu)化很重要，需要長期摸索適宜的條件。另外細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清成分十分復(fù)雜，不利于下游分泌蛋白的分離純化，因此探索一種低血清或無血清的培養(yǎng)基很重要。

由于重組蛋白帶有綠色熒光可在激發(fā)光下直接觀察，下一步試驗(yàn)可用pEGFP-N1-ZP3重組載體直接注射免疫草兔，研究其在活體內(nèi)的表達(dá)和免疫；也可以采用His標(biāo)簽代替GFP標(biāo)簽構(gòu)建重組載體，以制備His融合的ZP3蛋白，用Ni離子親和柱一步純化分離ZP3蛋白免疫草兔；同時(shí)也可以考慮用純化的蛋白和構(gòu)建好的重組真核表達(dá)載體同時(shí)注射草兔聯(lián)合免疫研究草兔免疫不育；另外，構(gòu)建病毒表達(dá)載體以及以特異性更強(qiáng)的兔黏液瘤病毒為載體來傳播疫苗也是一種途徑。

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Construction and expression of eukaryotic expression vector ofZP3 gene fromLepuscapensis(brown hare)

WU Jing-long,SUI Dan-dan,ZHANG Dong-hui,ZHOU Zhi-min, LI Hao,ZHENG Xue-li,HAN Chong-xuan

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The eukaryotic expression vector ofZP3 gene fromLepuscapensis(brown hare) was constructed by recombinant-DNA technique and expressed in RK-13 cells to improve the study of immunocontraception.【Method】 The ovarian RNA was purified from rabbit (Lepuscapensis) ovaries.The full-length ofZP3 gene cloned with RT-PCR was connected with the pEGFP-N1 vector to form pEGFP-N1-ZP3 expression vector before being expressed in RK-13 cells.The expression ofZP3 was detected with RT-PCR,Western Blot analysis and fluorescence microscopy.【Result】 The full-length ofZP3 gene was 1 260 bp,and the recombinant plasmid pEGFP-N1-ZP3 was successfully constructed.The recombinantZP3 obtained from RK-13 cells was 73 ku.Western Blot and RT-PCR further proved that the pEGFP-N1-ZP3 was expressedinvitro.【Conclusion】 This is the first study that successfully cloned the recombinantZP3 into eukaryotic expression vector and expressed it in RK-13 cells.

Lepuscapensis(brown hare);zona pellucida 3 (ZP3) gene;immunocontraception;pEGFP-N1;eukaryotic expression

時(shí)間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.002

2014-03-31

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)(201404405)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(QN2012036)

吳景龍(1986-)，男，河南南陽人，碩士，主要從事草兔免疫不育疫苗研究。E-mail：lifehouse635@163.com

韓崇選(1962-)，男，陜西西安人，教授，主要從事森林鼠、兔害治理研究。E-mail：sendakingcat@qq.com

S829.1

A

1671-9387(2015)11-0009-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.004.html