倪酈麗， 宋靚婧， 馬小媛， 吳世嘉， 段 諾， 王周平

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

基于Au/SiO2信號放大的人免疫球蛋白G電化學(xué)檢測新方法

倪酈麗， 宋靚婧， 馬小媛， 吳世嘉， 段 諾， 王周平*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

將人免疫球蛋白G（人IgG）固定到導(dǎo)電玻璃ITO表面，利用抗原抗體有特異性結(jié)合制備出一種電化學(xué)免疫傳感器。在導(dǎo)電玻璃ITO表面進(jìn)行氨基化戊二醛修飾處理后，鏈接羊抗人IgG；在二氧化硅微球表面進(jìn)行氨基戊二醛化，2~5 nm納米金通過靜電吸附在二氧化硅微球表面，利用H2O2進(jìn)一步將納米金還原后粒徑變大，鏈接羊抗人IgG?；贏u/SiO2信號放大效應(yīng)，利用人IgG對羊抗人IgG的特異性結(jié)合作用，人IgG分別與導(dǎo)電玻璃端和納米材料端相結(jié)合，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，建立了一種檢測人IgG的電化學(xué)免疫新方法。電極表面的氧化還原峰電流值與人IgG的濃度在1~200 ng/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.532 6x+ 409.256 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 8，檢測限為0.6 ng/mL。該電化學(xué)免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對人免疫球蛋白G低成本、超靈敏的檢測，有望應(yīng)用于人體血清檢測。

食品檢驗(yàn)；二氧化硅；人免疫球蛋白G；循環(huán)伏安法

電化學(xué)免疫分析法是將免疫分析與電化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的一種免疫分析新方法。免疫分析主要是基于用抗體（或抗原）作為選擇性化學(xué)試劑以分析測定抗原（或抗體）及半抗原。目前最廣泛的免疫檢測技術(shù)有免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA），免疫熒光技術(shù)（IFA），免疫凝集試驗(yàn)（IA）和免疫沉淀（IP），在生物檢測領(lǐng)域它們發(fā)揮了極其重要的作用[1]。

電化學(xué)免疫檢測技術(shù)是一種微量檢測新技術(shù)，主要用于生物活性物質(zhì)如抗原、抗體、激素等的檢測。它將免疫反應(yīng)的特異性和微電子技術(shù)結(jié)合，使免疫檢測具有精度高、速度快、適合于小型化和集成化，顯示了廣闊的發(fā)展前景[2-6]。

近年來，納米材料的出現(xiàn)在科學(xué)研究領(lǐng)域給人們以新的視野。納米材料的結(jié)構(gòu)決定了其產(chǎn)生的特殊效應(yīng)，這是常規(guī)材料無法具有的性能[7]。隨著人們對其研究愈來愈深入，人們已成功制備出各種納米材料，納米材料具有良好的導(dǎo)電性和宏觀隧道效應(yīng)，既能作為導(dǎo)線連接在生物分子與電極之間，又能起到加快異相界面電子傳遞速率的作用，增加了氧化還原物質(zhì)在電極表面反應(yīng)的可逆性，是優(yōu)良的電極或電極修飾材料[8-9]。二氧化硅納米材料由于其具有比表面積大、表面活性中心多、良好的單分散性、生物兼容性以及易功能化的特性被廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域[10-11]。納米金因?yàn)槠湮侥芰?qiáng)，具有良好的穩(wěn)定性和催化性能和導(dǎo)電性，而且能為蛋白質(zhì)提供一個與本體環(huán)境相似的微環(huán)境，也有助于蛋白質(zhì)與電極表面之間的直接電子轉(zhuǎn)移而被廣泛應(yīng)用[12-14]。此外，納米金在分析檢測方面有著廣泛的應(yīng)用，如李井泉等[15]利用納米金標(biāo)記黃曲霉毒素B1檢測AFB1。

免疫球蛋白G是主要存在于人體血漿中含量最高的抗感染抗體，約占總免疫蛋白的70%~75%，其含量的高低往往作為慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的參考值，所以對其含量檢測意義重大?，F(xiàn)有對人免疫球蛋白G檢測方法有壓電免疫傳感器技術(shù)、酶免疫法和熒光免疫法等[16]。

作者通過構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器用于檢測人免疫球蛋白G（人IgG），利用抗體-抗原的特異性結(jié)合反應(yīng)，使得導(dǎo)電玻璃ITO表面鏈接羊抗人IgG，羊抗人IgG標(biāo)記SiO2/GNPs納米復(fù)合顆粒，利用人IgG對羊抗人IgG的特異性結(jié)合作用，人IgG分別與導(dǎo)電玻璃端和納米材料端相結(jié)合，形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，基于Au/SiO2信號放大效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對人IgG的電化學(xué)檢測。通過紫外分光光度計(jì)（UV-1800）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）、透射電子顯微鏡（TEM）、以及電化學(xué)方法表征從而實(shí)現(xiàn)對人IgG的免疫分析，建立了一種檢測限低，靈敏度高的檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊抗人IgG（AB-0011）、人IgG（AG-0011）：購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；氯金酸（HAuCl4）、導(dǎo)電玻璃ITO：購自深圳華南湘城科技有限公司；人血清：江南大學(xué)校醫(yī)院提供；氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、硼氫化鈉（NaBH4）、亞鐵氰化鉀（K4Fe（CN）6·3H2O）、碳酸鉀（K2CO3）、雙氧水（H2O2）、濃氨水、正硅酸四乙酯（TEOS）、戊二醛、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、無水乙醇、丙酮、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）：均購自國藥化學(xué)試劑，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

紫外分光光度計(jì) （UV-1800），JEM-2100HR透射電子顯微鏡：日本JEOL公司產(chǎn)品；三電極體系：導(dǎo)電玻璃ITO工作電極、鉑絲對電極、銀/氯化銀參比電極；CHI660D電化學(xué)工作站：上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠產(chǎn)品；DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器：河南鞏義市予華儀器廠產(chǎn)品；Direct-Q3超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ITO導(dǎo)電玻璃的修飾ITO導(dǎo)電玻璃經(jīng)洗滌劑、超純水、丙酮、無水乙醇各超聲15 min，氮?dú)獯蹈珊蠓庞隗w積分?jǐn)?shù)1%APTES的無水乙醇中，37℃反應(yīng)12 h，用無水乙醇超聲洗滌5次，置于120℃烘箱中放置3 h。

將氨基化處理的ITO浸入pH7.4的緩沖溶液中常溫放置20 min，氮?dú)獯蹈?。再將ITO放于體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛的PBS溶液中常溫反應(yīng)2 h，用PBS、超純水洗滌后氮?dú)獯蹈桑賹TO放于質(zhì)量濃度為400 ng/mL的羊抗人IgG溶液中，37℃搖床反應(yīng)1 h后用超純水洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.2 抗體標(biāo)記的SiO2/GNPs的制備

1）二氧化硅的制備 參照Stober[17]溶膠-凝膠法方法，在20 mL無水乙醇和10 mL超純水中，加入5 mL氨水，混勻加入1.5 mL TEOS和5 mL無水乙醇，待磁力攪拌器溫度升至30℃后，恒溫磁力攪拌器攪拌12 h后，加入400 μL的APTES，繼續(xù)攪拌2 h，離心洗滌加入體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛溶液，常溫條件下磁力攪拌2 h，7 200 r/min離心10 min，重復(fù)以上操作3~4次重新分散于PBS中。

2）納米金的制備 將預(yù)冷的200 mL超純水置于磁力攪拌器上，加入體積分?jǐn)?shù)1%的HAuCl43 mL、0.2 mol/L的K2CO3溶液1 mL，攪拌均勻后迅速加入9 mL的0.5 mg/mL NaBH4。待溶液由最初的淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)攪拌10 min，得到2~5 nm粒徑的納米金。

3）SiO2/GNPs的制備 取上述制備的戊二醛化的SiO22 mL超聲分散于20 mL的超純水中，逐滴加入到納米金溶液中，持續(xù)攪拌1 h，離心清洗后超聲分散得到SiO2/GNPs。稀釋SiO2/GNPs溶液使得紫外吸收值2.5，得到滿足濃度的SiO2/GNPs溶液。

稱取25 mg K2CO3溶于100 mL超純水中，磁力攪拌10 min，加入體積分?jǐn)?shù)1%的HAuCl4溶液1.5 mL，持續(xù)攪拌20 min，得到Au/K2CO3生長溶液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 mL的SiO2/GNPs溶液中，加入240 mL的Au/K2CO3與4 mL 0.132 mol/L的H2O2水溶液，常溫條件下磁力攪拌20 min后，3 000 r/min離心30 min，重復(fù)以上操作3~4次后超聲得到大粒徑的SiO2/GNPs納米復(fù)合顆粒，加入0.02 mg/mL濃度的羊抗人IgG 2 mL，37℃搖床中反應(yīng)1 h，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，重復(fù)3次后超聲分散于超純水中，稀釋SiO2/GNPs/羊抗人IgG溶液使得紫外吸收值2，得到滿足濃度的SiO2/GNPs/羊抗人IgG溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電化學(xué)檢測配制鐵鉀電解液：準(zhǔn)確稱取KCl：7.45 g、K3[Fe（CN）6]：0.329 g、K4[Fe（CN）6]：0.422 g，定容至100 mL。

鏈接羊抗人IgG的ITO與不同濃度的人IgG，37°C搖床反應(yīng)1 h后用超純水充分洗滌3次，以除去非特異性吸附的人 IgG，再加入 0.1 mL SiO2/ GNPs/羊抗人IgG溶液，37℃特異性結(jié)合反應(yīng)1 h后，再用超純水充分清洗除去非特異性吸附的納米復(fù)合顆粒，形成三明治型免疫復(fù)合結(jié)構(gòu)。將三電極系統(tǒng) （以ITO三明治型免疫復(fù)合物為工作電極，以銀/氯化銀為參比電極，以鉑絲為對電極）置于上述所制電解液中，起始電壓設(shè)定為-0.2 V，掃描速率為100 mV/s，開機(jī)預(yù)熱后30 min后，用循環(huán)伏安法和阻抗頻譜法對ITO鏈接的免疫復(fù)合材料進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)圖

圖1所示為基于Au/SiO2信號放大的人免疫球蛋白G電化學(xué)免疫傳感檢測原理圖。導(dǎo)電玻璃經(jīng)過氨基化以及戊二醛修飾后成功鏈接羊抗人IgG；參考Stober[17]溶膠-凝膠法制備的二氧化硅微球同樣經(jīng)過氨基化戊二醛修飾后，將預(yù)先制備的2~5 nm納米金通過靜電吸附作用均勻的吸附在二氧化硅微球表面，H2O2將2~5 nm的納米金還原后，納米金的粒徑變大以增大電化學(xué)信號，通過戊二醛鏈接作用成功修飾羊抗人IgG。利用抗原抗體的特異性結(jié)合作用，將修飾了羊抗人IgG的導(dǎo)電玻璃、人IgG、羊抗人IgG修飾的納米材料三者形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，用電化學(xué)方法進(jìn)行表征，成功建立了檢測人IgG的電化學(xué)免疫傳感器。

2.2 ITO表面修飾以及表征

利用循環(huán)伏安法對導(dǎo)電玻璃ITO每步修飾做了表征。從圖2可以看出，空白導(dǎo)電玻璃ITO由于沒有鏈接任何物質(zhì)，空白導(dǎo)電玻璃ITO導(dǎo)電性最強(qiáng)，電流強(qiáng)度最大，隨著依次在導(dǎo)電玻璃ITO表面修飾上氨基、戊二醛、羊抗人IgG、人IgG后，使ITO表面阻值逐漸增大，導(dǎo)電性能減弱，相應(yīng)的峰電流值不斷減下（如圖2中曲線a、曲線b、曲線d、曲線e、曲線f），也同時證明了導(dǎo)電玻璃ITO表面修飾成功。最后，當(dāng)鏈接了人IgG的導(dǎo)電玻璃與SiO2/GNPs/羊抗人IgG反應(yīng)鏈接后，電流強(qiáng)度有明顯增大趨勢（圖2中曲線c所示），這是由于SiO2表面靜電吸附的納米金具有導(dǎo)電性，促進(jìn)電子的傳遞，從而能達(dá)到信號放大的作用。

2.3 SiO2納米材料表面修飾表征

圖3是SiO2的透射電子顯微鏡圖，可以看出在乙醇相中分散性良好，粒徑大小約為80 nm，相對比較均一。圖4是氨基化的SiO2紅外表征圖，SiO2納米顆粒的非對稱Si-O-Si伸縮振動峰顯示在最強(qiáng)的吸收峰1 099 cm-1處，3 433 cm-1是強(qiáng)吸收峰為NH的伸縮振動吸收峰，1 633 cm-1處的振動吸收峰為一級胺的N-H剪式振動吸收峰，紅外圖譜表明在SiO2納米材料表面已經(jīng)成功修飾上氨基。

2.4 H2O2還原前后的Au/SiO2表征

圖5（a）是納米金顆粒已經(jīng)通過靜電吸附作用成功吸附在SiO2納米材料表面，形成Au/SiO2納米復(fù)合材料。Au/SiO2通過H2O2的還原性作用將包覆在SiO2表面的納米金顆粒增大。圖5（b）顯示經(jīng)H2O2還原后，SiO2納米材料外包覆的納米金顆粒有明顯增大趨勢。

圖3 氨基化SiO2納米材料的TEM圖Fig.3 TEM image of SiO2NPs

圖4 氨基化SiO2納米材料的紅外圖譜Fig.4 IR spectra of amine-functionalized SiO2NPs

圖5 Au/SiO2納米復(fù)合材料（a）與H2O2還原后Au/SiO2納米復(fù)合材料（b）的TEM圖Fig.5 TEM image of Au/SiO2NPs（a）and Au/SiO2reducted by H2O2（b）

圖5是Au/SiO2復(fù)合材料經(jīng)H2O2還原前后紫外可見吸收對比圖。未經(jīng)H2O2還原的Au/SiO2納米復(fù)合材料在520 nm處有明顯紫外吸收峰，經(jīng)H2O2還原作用后，納米金顆粒粒徑增大，在570 nm處有明顯紫外吸收峰，吸收峰明顯紅移，這是因?yàn)榧{米金的粒徑大小與紫外可見吸收峰有一定關(guān)系，隨著納米金粒徑變大，納米金的最大紫外吸收波長就會發(fā)生紅移。因?yàn)镾iO2微球表面的納米金粒徑增大使得納米金量增多，紫外可見吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)。證明H2O2成功還原Au/SiO2，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 H2O2還原前Au/SiO2與H2O2還原后Au/SiO2紫外可見吸收對比圖譜Fig.6 UV-visibleabsorption spectrum ofAu/SiO2reducted by H2O2compared with Au/SiO2

2.5 反應(yīng)條件優(yōu)化

考察人IgG與ITO/羊抗人IgG特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)時間對循環(huán)伏安電流的影響。如圖7表明，當(dāng)人IgG溶液加入到鏈接了羊抗人IgG的導(dǎo)電玻璃中后，結(jié)合時間從20 min延長到80 min，隨著孵育時間延長，人IgG與羊抗人IgG結(jié)合量越多，整體阻值不斷變大，循環(huán)伏安電流強(qiáng)度逐漸減小，當(dāng)時間大于60 min后，循環(huán)伏安電流值降到最小，時間繼續(xù)延長響應(yīng)電流趨于平穩(wěn)，說明當(dāng)孵育時間為60 min時，人IgG與導(dǎo)電玻璃ITO表面羊抗人IgG之間的特異性結(jié)合基本完成。因此孵化時間選為60 min。

圖8為檢測孵育溫度20~45℃的響應(yīng)電流信號，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的不斷升高，人IgG與羊抗人IgG特異性結(jié)合越充分，阻值增大進(jìn)而使得循環(huán)伏安電流值不斷減小，當(dāng)溫度超過了37℃以后信號有小幅上升，這是由于在37℃條件下，ITO/羊抗人IgG與人IgG結(jié)合效果量達(dá)到最大值，導(dǎo)電玻璃鏈接物質(zhì)達(dá)到最大使得阻值最大，因而循環(huán)伏安電流值最小，選擇37℃為最佳孵育溫度。

圖7 ITO表面羊抗人IgG與人IgG不同孵育時間的循環(huán)伏安電流強(qiáng)度Fig.7 Cyclic voltammograms current value of different incubation time of the reaction of second antibody and antibody on the ITO

圖8 不同孵育溫度條件下循環(huán)伏安電流值Fig.8 Cyclic voltammograms current value of different incubation temperature

2.6 人免疫球蛋白G的檢測

將人IgG稀釋，分別選取人IgG質(zhì)量濃度為空白、0.01、0.1、1、10、100、150、200、250、350 ng/mL。如圖9中所示，隨著在電化學(xué)免疫傳感器中人IgG質(zhì)量濃度的不斷增大，阻抗圖中的半徑逐漸增大即阻抗不斷增大，相應(yīng)的在圖10中顯示為氧化還原峰電流值不斷減小，這是因?yàn)殡S著免疫傳感器中人IgG質(zhì)量濃度不斷增多，導(dǎo)電玻璃ITO表面鏈接的復(fù)合物質(zhì)也會不斷增多，因而導(dǎo)致了免疫傳感器中氧化還原峰電流值不斷減小。圖11表明，氧化還原峰電流值與人IgG質(zhì)量濃度在1~200 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.532 6x+ 409.256 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 8，檢測限為0.6 ng/mL。

圖9 1～350 ng/mL人IgG的阻抗頻譜圖Fig.9 Impedance spectrum of 1～350 ng/mL of immunoglobulin G

圖11 檢測人IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11 Correlation of detection immunoglobulin G

2.7 實(shí)際血樣中人IgG的檢測

正常人血清中人免疫球蛋白G含量在8~14 g/L，取正常人血清用0.01 mol/L的PBS緩沖溶液稀釋至檢測限線性范圍內(nèi)后，用以上制備的免疫傳感器測得 5個樣品中人IgG質(zhì)量濃度分別為9.2、10、7.9、8.3、9.1 g/L，向每個人血清樣品中加入人IgG標(biāo)準(zhǔn)品 9 g/L，測得回收率分別為 96.2%、98.8%、101.6%，、97.7%、94.5%（表1）。結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)方法可用于實(shí)際樣品的檢測。

表1 人血清中的IgG濃度檢測結(jié)果Table 1 Results of IgG decetion in human serum

3 結(jié)語

作者構(gòu)建了一種簡單靈敏的電化學(xué)免疫傳感器，采用三明治夾心型模式檢測人免疫球蛋白G。此傳感器利用ITO低成本，低阻值，結(jié)合金納米粒子良好的導(dǎo)電性得以信號放大的優(yōu)點(diǎn)，極大的提高了靈敏度。此電化學(xué)免疫傳感器穩(wěn)定性好，可有效改善電極表面的生物相容性和電子傳遞速率，可實(shí)現(xiàn)對人體血清中免疫球蛋白G的檢測。

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NI Lili， SONG Liangjing， MA Xiaoyuan， WU Shijia， DUAN Nuo， WANG Zhouping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To develop a novel electrochemical immune biosensor based on antigen-antibody reaction with the immunoglobulin G immobilized the surface of the ITO.The side of ITO was immobilized the goat anti-human IgG after the amino-modified and glutaraldehyde modification. The side of SiO2also had the same modification of amino and Glutaraldehyde，and then 2~5 nm gold nanoparticles adsorbing the surface of SiO2by the use of electrostatic interaction.We immobilized the goat anti-human IgG after the reduction of H2O2with bigger gold nanoparticles. When human IgG respectively combined with the ITO and nanomaterials，it would form the sandwich structure of a new detection of immunoglobulin G based on Au/SiO2to amplify signal amplification.The prepared biosensorshowed a excellentlinearity relationship ofCyclic voltammograms current value and the concentration of immunoglobulin G 1~200 ng/mL，theequation of linear regression is y=-0.532 6x+409.256 7（R2=0.994 8），with a detection limit of 0.6 ng/mL.The established method is low cost and ultrasensitive，and can be used to detect immunoglobulin G.

food analysis，silicon dioxide，immunoglobulin G，cyclic voltammetry

R 392-33

A

1673—1689（2015）01—0047—07

2014-03-22

教育部高等學(xué)校自主科研重點(diǎn)項(xiàng)目（JUSRP51309A）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-11-0663）；教育部博士點(diǎn)博導(dǎo)基金（20110093110002）；江蘇省科技支撐-社會發(fā)展項(xiàng)目（BE2012614）。

*通信作者：王周平（1974—），男，陜西寶雞人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn