許 偉，姜慧仙，鄭 劍，仲山民，王 超，常銀子

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

水酶法提取板栗殼棕色素工藝條件的篩選

許 偉，姜慧仙，鄭 劍，仲山民，王 超，常銀子

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

為了確定水酶法提取板栗殼棕色素的工藝條件，以板栗殼為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對其工藝條件進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，水酶法提取板栗殼棕色素的最適工藝條件為：復(fù)合酶總酶量2.0%，纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶質(zhì)量比為2∶3∶5，酶處理pH值5.0，溫度50 ℃，時間2.0 h，料液比1∶120。

板栗殼；棕色素；復(fù)合酶；工藝條件

板栗Castanea mllissimaBlume屬殼斗科Fagaccac栗屬堅(jiān)果類植物，為多年生落葉喬木。板栗在我國分布多達(dá)26個省（市、自治區(qū)），產(chǎn)量居世界第1位，達(dá)到全世界板栗產(chǎn)量的60%以上[1-4]。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)對板栗殼化學(xué)成分以及色素研究的報道較少且不完整。板栗殼棕色素含有苯環(huán)及羥基，而不具有典型黃酮類色素結(jié)構(gòu)，色素水溶液對光、熱及氧化劑和還原劑的耐受力較強(qiáng)[5]。吳龍?jiān)频萚6]首次從板栗殼中分離得到2種化合物，分別為4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、沒食子酸乙酯。魯曉翔等[7]人從板栗殼中提取多酚類物質(zhì)。

目前，關(guān)于酶法提取板栗殼棕色素的研究尚未有報道。酶法提取過程中植物組織經(jīng)酶制劑處理后，細(xì)胞壁及包裹色素的成分，如蛋白質(zhì)、淀粉等被分解，使細(xì)胞內(nèi)色素成分充分釋放出來，同時具有工藝簡單，條件溫和，對活性成分破壞小，節(jié)約能源，安全環(huán)保等特點(diǎn)[8-10]，使得酶法提取已被廣泛應(yīng)用于植物活性成分提取中。水酶法提取色素，應(yīng)用水作為提取溶劑，經(jīng)濟(jì)又方便。因此對水酶法提取板栗殼棕色素的研究具有重要意義。

本試驗(yàn)中通過酶種類的篩選，研究了水酶法從板栗殼中提取棕色素的工藝條件，旨在為利用板栗殼提取植物化學(xué)成分提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用板栗為浙江主產(chǎn)品種毛板紅。

試劑：鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；纖維素酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶、果膠酶（酶活≥30 U/mg，F(xiàn)LUKA）。

儀器：紫外分光光度計(jì)（UV-2550，日本島津公司）；電子天平（AL204，上海電子天平亞津衡器有限公司）；組織搗碎機(jī)（A-88，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；數(shù)顯pH計(jì)（PHS-25，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9053AD，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，國華電器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 原料預(yù)處理

選擇新鮮飽滿，大小均勻，無蟲蛀、霉?fàn)€的優(yōu)質(zhì)板栗，生剝殼后，放入50 ℃鼓風(fēng)烘箱中干燥60 min，粉碎過50目篩，貯存于黑暗陰涼處，待用。

1.2.2 提取工藝流程

稱取一定量的板栗殼粉末于錐形瓶中，加入一定體積蒸餾水，在50 ℃水浴中浸提1.0 h。再用1.0%的NaOH和1.0%的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值，并加入預(yù)先設(shè)計(jì)好的酶的種類與劑量，在水浴中酶解一定時間。將酶解后的提取物放置在80 ℃水浴中滅酶10 min。再加入蒸餾水進(jìn)行提取，調(diào)節(jié)pH至9.0，在80 ℃水浴中浸提2.0 h。室溫冷卻后，濾液直接過濾進(jìn)行定容。

1.2.3 吸收峰的測定

在未加酶情況下，進(jìn)行上述試驗(yàn)，找特征性最大吸收波長。

1.2.4 吸光值的測定

預(yù)測定容后的色素提取液吸光值，通過稀釋將其控制在0.500～1.000的范圍內(nèi)。本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]～[11]進(jìn)行，每組試驗(yàn)平行3次，取平均值作圖分析。

1.2.5 吸收波長的測定

稱取0.5 g板栗殼粉末于250 mL錐形瓶中，在50 ℃、pH值9.0、料液比1∶200的條件下浸提2.0 h，過濾后定容，進(jìn)行板栗殼棕色素吸收波長的測定，確定其最大吸收波長。

圖1 板栗殼棕色素水溶液吸收光譜Fig. 1 The absorption spectrum of aqueous solution of brown pigment from chestnut shell

圖2 沒食子酸水溶液吸收光譜Fig. 2 The absorption spectrum of aqueous solution of gallic acid

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼棕色素的紫外光譜分析

板栗殼棕色素水溶液和沒食子酸水溶液的吸收光譜分布見圖1和圖2。由圖1可見，板栗殼棕色素水溶液在205 nm附近有個較強(qiáng)的吸收峰，在274 nm附近有1個中等強(qiáng)度的吸收峰，這與圖2中沒食子酸水溶液吸收光譜相近，沒食子酸水溶液在219 nm附近有個較強(qiáng)的吸收峰，在266 nm附近有1個中等強(qiáng)度的吸收峰。由吳龍?jiān)频萚6,12]的研究可知，板栗殼棕色素中含有沒食子酸，而由藍(lán)海等[13-15]關(guān)于沒食子酸提取的研究中，分別采用273、271、267 nm的測定波長可推斷，板栗殼棕色素水溶液光譜圖中的中等強(qiáng)度吸收峰可以作為板栗殼棕色素水溶液的特征吸收峰，用于試驗(yàn)測定。因此，本次試驗(yàn)中確定測定波長為274 nm。

2.2 酶提取工藝試驗(yàn)

2.2.1 酶種類的確定

本次試驗(yàn)選用纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶。酶種類對吸光值的影響如圖3所示。由圖3可見，纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶對吸光值均有不同程度的影響，而對吸光值影響較大的酶有纖維素酶、中性蛋白酶和果膠酶。因此，本次試驗(yàn)選用纖維素酶、中性蛋白酶和果膠酶進(jìn)行酶的復(fù)合試驗(yàn)。

2.2.2 最適單酶酶量的確定

單酶酶量對吸光值的影響如圖4所示。由圖4可見，添加纖維素酶、中性蛋白酶及果膠酶在一定程度上均可增加板栗殼棕色素水溶液的吸光值。對于中性蛋白酶和果膠酶，其酶量在0～1 200 U/g（每克板栗殼干粉對應(yīng)的酶活力單位數(shù)）范圍，隨著酶量的增加，吸光值呈上升趨勢，當(dāng)酶量大于1 200 U/g后，吸光值曲線逐漸趨于水平；而纖維素酶的酶量在800 U/g時方使吸光值達(dá)最高。因此，確定纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶各自的最適酶添加量分別為 800、1 200、2 000 U/g。

圖 3 酶種類對吸光值的影響Fig. 3 Effect of enzyme kind on light absorbance value

圖4 單酶酶量對吸光值的影響Fig. 4 Effect of single enzyme amount on light absorbancevalue

2.2.3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)

（1）正交試驗(yàn)因素和水平的選取

植物細(xì)胞壁組成復(fù)雜，單一酶酶解的效果有限，多酶的復(fù)合作用會具有更明顯的效果。因此，為了進(jìn)一步探討復(fù)合酶的作用效果，本次試驗(yàn)中根據(jù)單酶酶量的單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L4(23)的正交試驗(yàn)，以確定最適復(fù)合酶配比。正交試驗(yàn)中因素及水平的選取見表1。

表 1 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion U/g

（2）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，其極差分析結(jié)果見表3。

表 2 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)的結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal experiment of composite enzyme proportion

表 3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 3 Range analysis of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

根據(jù)表3中極差分析結(jié)果可以看出：本次試驗(yàn)中選用的3種酶對板栗殼棕色素提取率的影響由高到低依次為：纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶，即B＞A＞C。

復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和多重比較結(jié)果分別見表4和表5。由表4中方差分析結(jié)果可以看出：中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶對色素提取率均有極顯著影響（P＜0.01），并且與極差分析結(jié)果一致。結(jié)合方差分析結(jié)果和極差分析結(jié)果，本次試驗(yàn)中選取處理1作為最適復(fù)合酶配比試驗(yàn)結(jié)果。最適配比為B1A1C1，即纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶質(zhì)量比為2∶3∶5。

2.3 復(fù)合酶酶解工藝試驗(yàn)

2.3.1 最適總酶量的確定

最適總酶量篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。總酶量在0.5%～2.0%范圍內(nèi)，吸光值隨復(fù)合酶總酶量的增大而增大，大于2.0%時，吸光值曲線逐漸趨于水平。在酶促反應(yīng)中，酶濃度越高反應(yīng)速度越快，但過高速度增加反而不明顯，綜合考慮酶制劑成本，選擇2.0%的總酶量。

表 4 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

表 5 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果的多重比較?Table 5 Multiple compares of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

圖 5 復(fù)合酶總酶量對吸光值的影響Fig. 5 Effect of total composite enzyme amount on light absorbance value

2.3.2 最適酶解pH值的確定

最適酶解pH值篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在pH值3.5～4.5的范圍內(nèi)，吸光值隨著pH值的增加而增大；在pH值4.5～5.5的范圍內(nèi)，吸光值逐漸減小；在pH值5.5之后，吸光值反而呈遞增趨勢。在pH值5.5之前的變化主要由于酶受pH值的影響所致，在pH值4.5時，復(fù)合酶達(dá)到最適pH值。

圖 6 酶解pH值對吸光值的影響Fig. 6 Effect of enzymolysis pH value on light absorbance value

2.3.3 最適酶解溫度的確定

最適酶解溫度篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。在反應(yīng)的初始階段，隨著溫度的升高吸光值在增大，但超過50 ℃，吸光值反而下降。低于50 ℃，酶活不能充分發(fā)揮，酶反應(yīng)速度過低導(dǎo)致色素不能充分溶出，在此溫度范圍內(nèi)，溫度升高可提高反應(yīng)速度。超過此溫度酶逐漸失活，減少了參與反應(yīng)的分子數(shù)，反應(yīng)速度逐漸降低。由此確定復(fù)合酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖 7 酶解溫度對吸光值的影響Fig. 7 Effect of enzymolysis temperature on light absorbance value

2.3.4 最適酶解時間的確定

最適酶解時間篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。在反應(yīng)初期2.0 h內(nèi)，由于底物濃度最大，酶與底物充分結(jié)合，酶的作用位點(diǎn)也最多，反應(yīng)隨時間延長，吸光值增大較明顯。超過2.0 h，隨著酶解的繼續(xù)進(jìn)行，底物濃度逐漸減少，反應(yīng)位點(diǎn)也相應(yīng)減少，酶解產(chǎn)物濃度增加，對酶促反應(yīng)起到反饋抑制作用，反應(yīng)達(dá)平衡時，吸光值趨于平緩。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益與時間效率等因素，酶解時間確定為2.0 h。

2.3.5 復(fù)合酶酶解條件正交試驗(yàn)

根據(jù)復(fù)合酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果，在一定條件下，總酶量、酶解pH值、溫度和時間，對色素的提取均有顯著的影響，為了進(jìn)一步探討，選擇酶解pH值、溫度、時間這3個因素進(jìn)行L9(33)的正交試驗(yàn)，以確定最佳酶解工藝條件。

（1）正交試驗(yàn)因素和水平的選取

復(fù)合酶酶解條件篩選正交試驗(yàn)的因素和水平見表6。

圖 8 酶解時間對吸光值的影響Fig. 8 Effect of enzymolysis time on light absorbancevalue

表 6 復(fù)合酶酶解條件篩選正交試驗(yàn)的因素和水平Table 6 Factors and levels of the orthogonal experiment of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

（2）正交試驗(yàn)結(jié)果和分析

復(fù)合酶酶解條件篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果見表7，極差分析、方差分析、多重比較分析結(jié)果分別見表 8～ 10。

表 7 復(fù)合酶酶解條件篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The result of the orthogonal experiment of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

表 8 復(fù)合酶酶解條件篩選正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 8 Range analysis of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

表 9 復(fù)合酶酶解條件篩選正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 9 Variance analysis of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

根據(jù)表8中極差分析結(jié)果可以看出：影響板栗殼棕色素提取率的因素的主次順序依次為：時間、溫度、pH值，即B＞A＞C。

從表9中的方差分析結(jié)果可以看出：從色素提取液的吸光值來看，酶解溫度、時間、pH值對色素的提取率均有極顯著的影響（P＜0.01），并且與極差分析結(jié)果一致。

根據(jù)表10中因素的各個處理間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合方差分析和極差分析結(jié)果，并考慮成本等因素，本次正交試驗(yàn)的最佳工藝組合應(yīng)做如下選取：時間（B）取2.0 h（B2），溫度（A）取50 ℃（A2），pH值（C）取5.0（C3）。由此，水酶法提取板栗殼棕色素的最佳組合為B2A2C3，即酶解時間2.0 h，溫度50 ℃，pH值5.0。

表 10 復(fù)合酶酶解條件篩選正交試驗(yàn)結(jié)果的多重比較Table 10 Multiple compares of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

2.3.6 料液比的確定

料液比對吸光值的影響如圖9所示。由圖9可以看出，料液比值大時，底物濃度過高，但溶劑溶解能力有限，因此料液比在1∶(80～120)范圍內(nèi)，色素水溶液吸光值逐漸增加；料液比值小時，底物濃度過低，色素含量有限，色素反而被稀釋，在1∶120之后，色素水溶液吸光值減小。因此選取1∶120料液比。

圖 9 料液比對吸光值的影響Fig. 9 Effect of solid-liquid ratio on light absorbance value

3 小 結(jié)

本試驗(yàn)中對水酶法提取板栗殼棕色素的工藝條件進(jìn)行了研究，通過選酶試驗(yàn)、單酶酶量單因素試驗(yàn)和復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)，確定酶制劑種類為纖維素酶＋中性蛋白酶＋果膠酶復(fù)合酶制劑（質(zhì)量比為2∶3∶5）；又對復(fù)合酶總酶量、酶解pH值、溫度、時間和料液比等工藝條件進(jìn)行了篩選，并通過正交試驗(yàn)確定了從水酶法提取板栗殼棕色素的方案，得出了最適工藝條件。最適工藝條件為：復(fù)合酶總酶量2.0%，酶處理pH值5.0，溫度50 ℃，時間2.0 h，料液比1∶120。

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Screening of extraction process conditions of brown pigment from chestnut shell by enzymatic hydrolysis method

XU Wei, JIANG Hui-xian, ZHENG Jian, ZHONG Shan-min, WANG Chao, CHANG Yin-zi
(School of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, Zhejiang, China)

In order to obtain the optimal extraction process conditions of brown pigment from chestnut shell by enzymatic hydrolysis method, taking chestnut shell as materials, the process conditions were screened by several single factor experiments and a orthogonal experiment. The results showed that the optimal extraction process conditions were 2.0% composite enzymes, the mass ratio 2∶3∶5 of cellulose, neutral protease and pectinase, reaction pH value 5.0,temperature 50 ℃ , duration 2.0 h, and solid-liquid ratio 1 ∶ 120.

chestnut shell; brown pigment; composite enzymes; process conditions

S664.2

A

1003—8981(2015)02—0101—06

2014-12-20

浙江農(nóng)林大學(xué)科研啟動發(fā)展基金項(xiàng)目“板栗殼天然色素精制與應(yīng)用特性研究”（2008FR053）；木本糧油產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“油茶餅粕中茶籽多糖的提取與純化研究”（2011R50030-2）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y3110450）。

許 偉，碩士研究生。

鄭 劍，講師，碩士。E-mail：zhengjian622@126.com

許 偉,姜慧仙,鄭 劍,等.水酶法提取板栗殼棕色素工藝條件的篩選[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(2):101－106.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.018

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：聞 麗]