鄭新添，黃翠琴，黃其春，戴愛(ài)玲，譚曉珺

(龍巖學(xué)院 福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364000)

胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法的建立

鄭新添，黃翠琴，黃其春，戴愛(ài)玲，譚曉珺

(龍巖學(xué)院 福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364000)

【目的】 建立檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法，為豬增生性腸炎的準(zhǔn)確診斷奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?針對(duì)胞內(nèi)勞森菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增16S rDNA，構(gòu)建pT-LI-16S重組質(zhì)粒。以pT-LI-16S為模板建立檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法，檢測(cè)其特異性、敏感性和重復(fù)性，并用該方法對(duì)51份疑似增生性腸炎病例進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】 建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法特異性強(qiáng)，與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和副豬嗜血桿菌等無(wú)交叉反應(yīng)；在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒含量為1.0×102～1.0×108拷貝/μL時(shí)，質(zhì)粒含量與循環(huán)閾值(Ct)之間具有良好的線性關(guān)系(R2=0.992)，最小可檢測(cè)到10 拷貝/μL的重組質(zhì)粒；重復(fù)性檢測(cè)顯示其批內(nèi)變異系數(shù)小于2%。該方法對(duì)糞便及小腸組織中胞內(nèi)勞森菌的檢出率分別為46.9%和84.2%，高于普通PCR的檢出率(分別為40.7%和78.9%)?！窘Y(jié)論】 建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，能對(duì)胞內(nèi)勞森菌進(jìn)行快速檢測(cè)及定量分析，可用于豬增生性腸炎的診斷。

胞內(nèi)勞森菌；熒光定量PCR；豬增生性腸炎；檢測(cè)方法

由胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis)引起的豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteritis,PPE)是豬的一種接觸性腸道疾病，以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征[1]。PPE在全球豬場(chǎng)流行，嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率，給豬場(chǎng)造成了嚴(yán)重?fù)p失[2]，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)甚至亞洲的豬場(chǎng)，由胞內(nèi)勞森菌引起的增生性腸炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[4-5]。胞內(nèi)勞森菌是一種專(zhuān)性胞內(nèi)寄生菌，其生長(zhǎng)需要某些特定細(xì)胞，不能在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此不能采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法對(duì)PPE進(jìn)行診斷[6]。臨床上胞內(nèi)勞森菌以隱性感染居多，其導(dǎo)致的腸炎與豬圓環(huán)病毒引起的腸炎相似，肉眼難以區(qū)分，因此依臨床癥狀及剖檢病變僅可做出初步診斷，確診還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查[7]。本研究擬建立區(qū)別于普通PCR的檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的SYBR Green Ⅰ real-time PCR技術(shù)，旨在為PPE的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及胞內(nèi)勞森菌的定量檢測(cè)等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器 SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、pMD18-T載體、DNA回收試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和EcoRⅠ等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，糞便DNA提取試劑盒(Stool DNA Kit，Omega)購(gòu)自廈門(mén)鷺榮生物科技發(fā)展有限公司，2×PowerTaqPCR MasterMix和PCR產(chǎn)物回收試劑盒等購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品，全波長(zhǎng)讀數(shù)儀Multiskan GO為T(mén)hermo Scientific 公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株和樣品 豬回腸炎活疫苗LawsoniaintracellularisVaccine(Enterisol Ileitis)購(gòu)自勃林格殷格翰公司；大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、副豬嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌等均由福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存；51份疑似胞內(nèi)勞森菌感染樣品(糞便32份，腸組織19份)采集于2009-2014年送檢至龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所的豬只，患豬經(jīng)臨床和病理剖檢初步診斷感染PPE。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 以胞內(nèi)勞森菌的16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)：U30147)為靶基因，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)1對(duì)SYBR Green Ⅰ real-time PCR 引物：LI-f.5′-TTCTCCTTTCTCATGTCCCATAAG-3′，LI-r.5′-TGCTATCTCTGCTGCATGTAATG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為160 bp。參照文獻(xiàn)[8]合成1對(duì)檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的普通PCR引物：P1.5′-GCAGCACTTGCAAACAATAAACT-3′，P2.5′-TTCTCCTTTCTCATGTCCCATAA-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 引物特異性驗(yàn)證及標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒模板的構(gòu)建

1.2.1 核酸的提取 用于構(gòu)建real-time PCR的胞內(nèi)勞森菌核酸的提取方法為：取100 μL 胞內(nèi)勞森菌疫苗液，加入12 μL體積分?jǐn)?shù)10%的SDS和2 μL蛋白酶K(20 μg/mL)，37 ℃溫育1 h，95 ℃ 10 min，加入232 μL 無(wú)水乙醇，沉淀10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2遍，干燥后用20 μL TE 溶解。小腸組織胞內(nèi)勞森菌核酸的提取參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行；糞便中胞內(nèi)勞森菌DNA采用Stool DNA Kit試劑盒提取，方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pT-LI-16S的構(gòu)建 首先用PCR擴(kuò)增胞內(nèi)勞森菌 16S rDNA，其反應(yīng)體系為： 2×PowerTaqPCR MasterMix 10 μL，LI-f和LI-r 各0.5 μL, 胞內(nèi)勞森菌DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA回收試劑盒回收目的條帶，并將其與pMD18-T 載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-LI-16S。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組克隆子，進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR反應(yīng)條件的確立

建立20 μL反應(yīng)體系，以稀釋的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒為模板，對(duì)反應(yīng)溫度、引物濃度及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)循環(huán)閾值(Ct)、熒光強(qiáng)度及溶解曲線等的比較，判定最佳反應(yīng)條件。

1.4 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)

1.4.1 特異性 提取大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌等細(xì)菌的基因組DNA，以之及胞內(nèi)勞森菌核酸為模板，用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)，以胞內(nèi)勞森菌DNA為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)所建立方法的特異性。

1.4.2 敏感性 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒pT-LI-16S的OD260，按照1 OD260雙鏈DNA=50 ng/μL的換算關(guān)系計(jì)算質(zhì)粒的質(zhì)量濃度(A)，然后根據(jù)拷貝數(shù)=A/重組質(zhì)粒摩爾質(zhì)量×6.02×1023，將質(zhì)粒的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)濃度(拷貝/μL)，并將重組質(zhì)粒以10倍倍比梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)模板，用優(yōu)化的SYBR Green Ⅰ real-time PCR體系擴(kuò)增，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定熒光定量PCR的敏感性。

1.4.3 重復(fù)性 以重組質(zhì)粒pT-LI-16S為模板，取5個(gè)含量梯度，分別為1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103和1.0×102拷貝/μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次，在相同擴(kuò)增條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)，測(cè)定組內(nèi)變異系數(shù)，評(píng)價(jià)其重復(fù)性。

1.5 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的臨床應(yīng)用

將臨床采集的51份疑似PPE樣品，分別用普通PCR[10]和SYBR Green Ⅰ real-time PCR 檢測(cè)，比較兩者的檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pT-LI-16S的構(gòu)建

用real time PCR引物對(duì)胞內(nèi)勞森菌16S rDNA經(jīng)普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了與預(yù)期長(zhǎng)度160 bp一致的片段(圖1)。

圖1 胞內(nèi)勞森菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增
1.DNA標(biāo)樣；2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA ofLawsoniaintracellularis1.DNA Marker;2.PCR products

胞內(nèi)勞森菌重組質(zhì)粒pT-LI-16S的PCR鑒定(圖2，泳道1)及PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定 (圖2，泳道2，3)結(jié)果表明，該重組質(zhì)?？寺〉耐庠椿蛐蛄袨榘麅?nèi)勞森菌16S rDNA特異性片段。

圖2 重組質(zhì)粒pT-LI-16S的PCR鑒定和酶切鑒定
1.以pT-LI-16S為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2.重組質(zhì)粒pT-LI-16S的PstⅠ+EcoRⅠ雙酶切;3.重組質(zhì)粒pT-LI-16S;M.DNA標(biāo)樣
Fig.2 Recombinant plasmid identification using PCR and double enzyme digestion 1.PCR product amplified with pT-LI-16S as the template; 2.pT-LI-16S digested byPstⅠ+EcoRⅠ;3.Recombinant plasmid pT-LI-16S;M.DNA Marker

2.2 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法反應(yīng)條件的確立

對(duì)SYBR Green Ⅰ real-time PCR的引物濃度、反應(yīng)溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明20 μL 最佳反應(yīng)體系為： Premix ExTaq10 μL，上、下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。

2.3 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR的特異性檢測(cè)

用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，以大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌及副豬嗜血桿菌等為對(duì)照，對(duì)所建立的新方法的特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該反應(yīng)體系僅對(duì)胞內(nèi)勞森菌出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，而對(duì)照病原體均為陰性反應(yīng)(圖3)，表明建立的 real-time PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.4 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)

將已測(cè)定質(zhì)量濃度的重組質(zhì)粒pT-LI-16S經(jīng)過(guò)換算稀釋成1.0×100～1.0×109拷貝/μL，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖4-A；在模板含量為1.0×102～1.0×108拷貝/μL時(shí)，模板含量與Ct值之間的線性關(guān)系較好，其線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992，回歸方程為y=-3.180x+33.71(圖4-B)。模板含量為10 拷貝/μL 時(shí)其Ct值小于陰性對(duì)照Ct值，而當(dāng)模板含量為1 拷貝/μL時(shí)其Ct值與陰性對(duì)照組相同，因此該檢測(cè)法的最低檢測(cè)限為10拷貝/μL。

圖3 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR特異性的檢測(cè)
1.大腸桿菌；2.沙門(mén)氏菌；3.副豬嗜血桿菌；4.金黃色葡萄球菌；5.胞內(nèi)勞森菌
Fig.3 Specificity test onLawsoniaintracellularisSYBR Green Ⅰ real-time PCR
1.E.coli；2.Salmonella；3.Haemophilusparasuis；4.Staphylococcusaureus；5.L.intracellularis

圖4 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR的敏感性檢測(cè)
A.不同模板含量的擴(kuò)增曲線；B.Ct值與模板含量之間的擬合曲線
1～7.模板含量分別為1.0×108～1.0×102拷貝/μL
Fig.4 Sensitivity test ofLawsoniaintracellularisSYBR Green Ⅰ real-time PCR A.Amplification plot of each template concentration;B.Fitted cure ofCtvalue and templates concentration
1-7.Concentration of the template were 1.0×108-1.0×102copies/μL,respectively

2.5 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

以重組質(zhì)粒pT-LI-16S為模板，用5個(gè)含量梯度(1.0×102～1.0×106拷貝/μL)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，觀察不同組內(nèi)的變異情況，結(jié)果顯示，各次重復(fù)均有擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)(圖5)，上述5個(gè)梯度的組內(nèi)Ct變異系數(shù)(CV)在0.45%～1.53%(表1)，說(shuō)明該檢測(cè)法的重復(fù)性較好。

圖5 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR的重復(fù)性檢測(cè)

表1 胞內(nèi)勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR的重復(fù)性檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Repeatability test of Lawsonia intracellularis SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.6 SYBR Green Ⅰ real-time PCR與普通PCR臨床檢測(cè)結(jié)果的比較

將采集的51份PPE疑似樣品，分別用普通PCR和SYBR Green Ⅰ real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(表2)表明，SYBR Green Ⅰ real-time PCR對(duì)糞便、小腸組織中胞內(nèi)勞森菌的檢出率分別為46.9%和84.2%，高于普通PCR的檢出率(分別為40.7%和78.9%)。兩者的陽(yáng)性符合率為83.9%(26/31)，陰性符合率為90%(18/20)。

表2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)胞內(nèi)勞森菌臨床樣品的檢測(cè) Table 2 Detection of Lawsonia intracellularis in clinical samples by SYBR Green Ⅰ real-time PCR %

3 討 論

PPE的實(shí)驗(yàn)室診斷方法目前主要包括涂片鏡檢法、血清學(xué)方法、細(xì)菌分離培養(yǎng)法、傳統(tǒng)PCR等。涂片鏡檢法快速、簡(jiǎn)便，但特異性較差；胞內(nèi)勞森菌的細(xì)胞培養(yǎng)法操作繁瑣，且國(guó)內(nèi)未見(jiàn)成功分離的報(bào)道。通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)糞便中的胞內(nèi)勞森菌是目前最常用的適于屠宰前診斷PPE的方法[8,11]，盡管該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，且由于糞便中胞內(nèi)勞森菌的含量不高，同時(shí)存在PCR抑制因子，因此可能造成一定的假陰性。改進(jìn)的方法之一是建立敏感性更高、特異性更強(qiáng)的熒光定量PCR檢測(cè)方法。熒光定量PCR與普通PCR相比，除了特異性更強(qiáng)、敏感性更高外，還可避免交叉污染[12]，診斷的可靠性更高。TaqMan探針?lè)ê蚐YBR Green Ⅰ染料法是常見(jiàn)的2種實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方式，后者具有引物設(shè)計(jì)方便、成本較低等特點(diǎn)，因此更適合疫病檢測(cè)方法采用?；谏鲜鲈颍狙芯拷⒘艘惶讬z測(cè)胞內(nèi)勞森菌的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。

為提高real-time PCR的敏感性，在引物設(shè)計(jì)上，選擇了胞內(nèi)勞森菌基因組中同源性較高的16S rDNA序列[13]為靶基因作參考序列。同時(shí)，通過(guò)對(duì)real-time PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，使該方法最低可檢測(cè)到10拷貝/μL重組質(zhì)粒DNA，與TaqMan法的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)[14]。本研究建立的real-time PCR定量方法屬于絕對(duì)定量，該定量方法與相對(duì)定量相比，具有獲得基因絕對(duì)數(shù)量且不同試驗(yàn)結(jié)果可相互對(duì)比等優(yōu)點(diǎn)[15]。為了檢驗(yàn)real-time PCR方法的定量檢測(cè)性能，采用了具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[16]的質(zhì)粒法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立了模板含量與循環(huán)次數(shù)的擬合曲線。結(jié)果顯示在1.0×102～1.0×108拷貝/μL時(shí)，模板含量與Ct值之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2值為0.992。為檢驗(yàn)建立的real-time PCR檢測(cè)法在臨床上的應(yīng)用效果，對(duì)采集的51份疑似PPE病例樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示該SYBR Green Ⅰ real-time PCR法對(duì)糞便及腸組織中胞內(nèi)勞森菌的檢出率均高于普通PCR，顯示出臨床應(yīng)用價(jià)值。

總之，本研究建立的檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法特異性強(qiáng)、敏感度高，可用于小腸、糞便等樣品中胞內(nèi)勞森菌的定量檢測(cè)。

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Establishment of SYBR Green Ⅰ real-time PCR assay for detection ofLawsoniaintracellularis

ZHENG Xin-tian,HUANG Cui-qin,HUANG Qi-chun,DAI Ai-ling,TAN Xiao-jun

(FujianProvincialKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineandVeterinaryBiotechnology,LongyanUniversity,Longyan,Fujian364000,China)

【Objective】 The present study established a SYBR Green Ⅰ real-time PCR assay for detection ofLawsoniaintracellularis.【Method】 16S rDNA gene ofL.intracellularis,amplified by PCR using specific primers was cloned to construct recombinant plasmid pT-LI-16S.With the plasmid pT-LI-16S as template,the real-time PCR assay for detection ofL.intracellulariswas established and its specificity,sensitivity and repeatability were evaluated.The method was also applied to 51 clinical samples of porcine proliferate enteritis.【Result】 The established assay had no cross reaction withE.coli,Salmonella,StaphylococcusaureusandHaemophilusparasuis.There was a good linear relationship between the template concentration and theCtvalue when the standard template concentration was in range of 1.0×102-1.0×108copies/μL.The detection limit was 10 copies/μL recombinant plasmid.The repeatability test indicated that the intra-variations were less than 2%.The positive rates ofL.intracellularisin fecal and intestine tissue were 46.9% and 84.2%,respectively,both were higher than the rates (40.7% and 78.9%) tested by conventional PCR.【Conclusion】 The established real-time PCR assay was specific,sensitive,accurate and suitable for the quick detection and quantity analysis ofL.intracellularis.Thus,it can be used to diagnose porcine proliferative enteritis.

Lawsoniaintracellularis;real-time PCR;porcine proliferative enteritis;diagnosis

時(shí)間:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.006

2014-07-09

福建省教育廳A類(lèi)項(xiàng)目(JA11247)；福建省農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2011N0025)

鄭新添(1981-)，男，福建上杭人，講師，碩士，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究。E-mail:zh-xintian@163.com

黃翠琴(1978-)，女，福建寧化人，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)研究。 E-mail:Cuiqinh@126.com

S852.61;S858.283.21

A

1671-9387(2015)12-0029-06

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