任春陽，田 杰

(沈陽市第四人民醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110031)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法直接檢測陽性血培養(yǎng)瓶中大腸埃希菌

任春陽，田 杰

(沈陽市第四人民醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110031)

目的 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)建立一種快速敏感的直接檢測陽性血培養(yǎng)瓶中大腸埃希菌的方法。方法根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)上大腸埃希菌的lacZ(登錄號：M74750)基因序列，設(shè)計4條特異引物(2條內(nèi)引物、2條外引物)，對lacZ基因進行擴增，對擴增反應(yīng)進行優(yōu)化。分別驗證該方法的特異性及敏感性，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行比較。結(jié)果在300份陽性血培養(yǎng)瓶中，采用LAMP法檢測到68株大腸埃希菌，所設(shè)計引物對大腸埃希菌擴增的特異性及敏感性均較好，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，靈敏度和特異性均達100%，但傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢出時間為3 d，而LAMP法的檢出時間只需1 h。結(jié)論LAMP檢測大腸埃希菌是快速、低成本、特異性強、靈敏度高的方法，適合臨床開展。

環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)；檢測；大腸埃希菌

大腸埃希菌是臨床常見的重要致病菌，在引起敗血癥的病原菌中居首位[1]，目前，大腸埃希菌的檢測仍以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法(如分離培養(yǎng)、生化鑒定等)為主，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法操作繁瑣，費時費力，不能快速為臨床提供可靠的結(jié)果。PCR 方法檢測大腸埃希菌具有特異性強、靈敏度高等特點，但檢測成本較高，需要專門規(guī)劃設(shè)計的實驗室以及昂貴的儀器。2000年日本學(xué)者Notomi等[2]發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，現(xiàn)在應(yīng)用非常廣泛，包括病原微生物檢測[3-4]、寄生蟲檢測[5]、植物病檢測[6-7]、動物胚胎的性別鑒定[8]及植物種類鑒定[9]等領(lǐng)域。本研究直接從陽性血培養(yǎng)瓶中提取細菌DNA，使用LAMP擴增大腸埃希菌的lacZ基因，判斷是否為大腸埃希菌感染，可在1 h內(nèi)完成，縮短最終鑒定時間，以為臨床治療贏得時間。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2012 年1月至2013年4 月沈陽市第四人民醫(yī)院300份陽性血培養(yǎng)瓶，均為非重復(fù)株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853、 大腸埃希菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.1.2儀器與試劑 VIT EK 2 全自動微生物分析儀及其配套試劑為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，BACTEC9050全自動血培養(yǎng)儀由美國BD公司提供，恒溫箱為上海醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，低溫高速離心機為貝克曼公司產(chǎn)品，Bst DNA聚合酶(含10×Bst buffer)購自New England Biolabs公司；甜菜堿(betaine)購自Sigma公司；dNTP、MgSO4、DNA 標志物購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3引物 根據(jù)GenBank中大腸埃希菌lacZ基因序列，使用Primer ExplorerV4軟件設(shè)計一套LAMP引物，F(xiàn)3:5′-CAT GGG GGA TCC CAA GCT-3′，B3:5′-TTG TTA GCA GCC GGA TCA G-3′；BIP:5′-CCT TGC AGC ACA TCC CCC TTT GTT GGG AAG GGC GAT C-3′,FIP:5′-CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC ATA GAG GTA CCG CAT GCG ATA-3′。其中F3與B3為外引物，F(xiàn)IP與BIP為內(nèi)引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，用ddH2O溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1細菌DNA模板制備 采取鹽酸胍-苯甲醇法：(1)從陽性血培養(yǎng)瓶中以無菌方式取100 μL培養(yǎng)物置入1.5 mL的EP管中，加入5 mol鹽酸胍緩沖液100 μL，渦旋振蕩5 min；(2)依次加入400 μL雙蒸水和800 μL苯甲醇，渦旋振蕩1 min，在4 ℃下以7 000 r/min離心5 min；(3)取上層水相約0.4 mL到一新EP管，依次加入3 mol/L醋酸鈉緩沖液40 μL和異丙醇0.44 mL，在4 ℃下16 000 r/min離心15 min；(4)倒掉上層液體，加入1 mL 70%乙醇洗滌，在4 ℃下16 000 r/min離心10 min，接著倒掉上層的乙醇，待干燥后加入100 μL雙蒸水溶解管底的DNA沉淀備用。

1.2.2LAMP檢測大腸埃希菌 本試驗在先期研究中確定的最佳反應(yīng)體系如下：Bst DNA聚合酶(8 U)1.00 μL、Bst DNA聚合酶緩沖液(10×)2.50 μL、dNTP(10 mmol/L)1.20 μL、Betaine(5 mol/L)5.00 μL、MgSO4(100 nmol/L)1.50 μL、F3與B3(引物濃度為20 μmol/L)各0.25 μL、BIP與FIP(引物濃度為20 μmol/L)各2.00 μL、DNA模板2.00 μL，H2O 7.30 μL?；靹蚝螅?5 ℃等溫擴增1 h。

2 結(jié) 果

2.2LAMP特異性分析 在300份陽性血培養(yǎng)瓶中，采用傳統(tǒng)方法檢出大腸埃希菌68株，LAMP法產(chǎn)物電泳均有特征性條帶出現(xiàn)，非大腸埃希菌為陰性結(jié)果，見圖1。

M：標志物；1：大腸埃希菌ATCC 25922；2～6：臨床分離株；7：陰性對照；8：肺炎克雷伯菌；9：銅綠假單胞菌；10：鮑曼不動桿菌；11：金黃色葡萄球菌；12：表皮葡萄球菌；13：變形菌屬；14：肺炎鏈球菌。

圖1 特異性試驗結(jié)果

2.2LAMP靈敏度分析 將過夜培養(yǎng)的大腸埃希菌ATCC 25922制備成0.50麥氏濁度(相當于1.50×108CFU)，進行10倍倍比稀釋，然后提取不同濃度的大腸埃希菌基因組DNA為模板，進行LAMP反應(yīng)，加入SYBR Green I后，觀察結(jié)果，隨后進行電泳，結(jié)果呈綠色的反應(yīng)產(chǎn)物電泳時均出現(xiàn)特異性的階梯狀條帶，出現(xiàn) LAMP擴增反應(yīng)，其顏色變化情況與電泳結(jié)果一致，可以判定本方法的檢測極限約1.50×10 CFU/mL。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，靈敏度和特異性均達100%，但是傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢出時間為3 d，而LAMP法的檢出時間只需1 h。

3 討 論

大腸埃希菌是人體腸道中的正常寄生菌，但也是臨床各部位感染的重要致病菌，在引起血流感染的病原菌中占首位[10]。傳統(tǒng)上，對大腸埃希菌的診斷主要依靠平板培養(yǎng)分離鑒定法，但該方法檢測周期長達3 d，費時、費力，不利于臨床的快速診斷，所以尋找更快速、更簡易、更準確的檢測方法是臨床工作的發(fā)展方向。目前應(yīng)用最多的是 PCR 及其衍生出的 real-time PCR、巢式 PCR、RT-PCR 等方法[11]。這些方法的優(yōu)點是操作簡單，靈敏性高，可在短時間內(nèi)得到實驗結(jié)果。但是這些方法在檢測過程中，對精密儀器設(shè)備的要求極高且要掌握準確繁瑣的實驗程序步驟，對實驗室平臺及操作人員均有很高的要求。

LAMP是一種在等溫條件下快速，特異性、靈敏度高的擴增靶序列DNA技術(shù)，無需昂貴的儀器設(shè)備，可1 h內(nèi)即可完成全部反應(yīng)，使對大腸埃希菌的快速診斷成為可能。本研究采用鹽酸胍-苯甲醇法直接從陽性血培養(yǎng)瓶中提取細菌DNA，使用LAMP法檢測大腸埃希菌的lacZ基因，結(jié)果顯示大腸埃希菌呈陽性反應(yīng)，其他對照菌呈陰性反應(yīng)，可見LAMP 法具有良好的靈敏度和特異性，如果以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為“金標準”，其靈敏度和特異性均達到100%。而且該方法具有觀察結(jié)果方便、無需特殊儀器等優(yōu)點，適合各級醫(yī)院開展，尤其是一些中小型醫(yī)療機構(gòu)。

對于結(jié)果的觀察，可以采用肉眼觀察反應(yīng)體系中是否形成白色沉淀來定性判斷LAMP反應(yīng)[12]，但該方法的靈敏度較在反應(yīng)體系中加入熒光染料要低[13]。目前通常添加熒光染料如EB、SYBR Green I[14]、EvaGreen[15]等進行結(jié)果判斷。但也存在一定的缺陷，SYBR Green I和EvaGreen對LAMP反應(yīng)有抑制作用，而且需在反應(yīng)結(jié)束后添加，由于LAMP靈敏度高，較劇烈地搖動反應(yīng)管或開蓋都可形成氣溶膠而導(dǎo)致污染，引起假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。所以尋找一種能在反應(yīng)前加入且不影響反應(yīng)的指示劑，避免開蓋操作是亟待解決的問題。

綜上所述，LAMP法檢測陽性血培養(yǎng)瓶中大腸埃希菌的方法簡便快速，靈敏度和特異度非常高，檢測時間為1 h左右，較傳統(tǒng)方法明顯縮短，為患者的治療贏得了時間。但本方法的試驗未能檢測耐藥基因，這將需要進一步的研究。

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Direct detection of Escherichia coli in positive blood culture bottles by loop-mediated isothermal amplification method

RenChunyang,TianJie

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShenyangMunicipalFourthPeople′sHospital,Shenyang,Liaoning110031,China)

Objective To establish a rapid,sensitive direct method for detecting Escherichia coli(E.coli) in the positive blood culture bottles by using the loop-mediated isothermal amplification(LAMP).Methods Based on the lacZ (accession number:M74750) gene sequence of E.coli in the gene sequence GenBank by the National Institutes of Health(NIH),4 specific primers (2 inner primers and outer primers) were designed,the lacZ gene was amplified and the amplification reaction was optimized.The sensitivity and specificity of this method were verified and its comparison with the traditional culture method was conducted.Results Sixty-eight strains of E.coli were detected in 300 positive blood culture bottles by adopting the LAMP method.The designed primers had good sensitivity and good specificity for the amplification of E.coli.The sensitivity and specificity of LAMP all reached 100% compared with the traditional method,but the traditional method needed 3 d to get the results,while LAMP only needed 1 h.Conclusion LAMP is extremely rapid for detecting E.coli with low cost,strong specificity and high sensitivity and is suitable for clinical application.

loop-mediated isothermal amplification;testing;Escherichia coli

任春陽(1977-)，副主任檢驗師，碩士研究生，主要從事微生物及耐藥性方面的研究。

術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.025

R33

A

1671-8348(2015)11-1514-02

2014-11-01

2015-01-16)