孫冬生，高春艷，王志剛，劉 寧，賈鳳潔

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院腫瘤科，河北唐山 063000；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

UNC5C基因啟動子的甲基化狀況與大腸癌UNC5C的相關(guān)性分析

孫冬生1，高春艷1，王志剛2，劉 寧1，賈鳳潔1

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院腫瘤科，河北唐山 063000；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

目的 探討UNC5C基因啟動子的甲基化狀況與大腸癌UNC5C的相關(guān)性。方法選擇河北省唐山市開灤總醫(yī)院腫瘤科2010年2月至2013年3月共54例散發(fā)性大腸癌及相關(guān)正常黏膜組織，以及6個大腸癌細胞株和纖維細胞株(FCL)作為研究對象。對研究對象實施基因mRNA和甲基化分析。結(jié)果UNC5A和UNC5B的mRNA，在所檢測的大腸癌細胞株中均有表達。而UNC5C除FCL外，所有的癌細胞株中均無mRNA表達。在大腸癌組織中UNC5C的甲基化明顯高于正常黏膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均顯著高于未甲基化水平，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。依照Spearman法進行相關(guān)性分析，UNC5C缺陷與大腸癌疾病呈正相關(guān)(r=0.856，P<0.05)。結(jié)論Netrin-1受體UNC5C缺陷與大腸癌具有一定相關(guān)性。

Netrin-1受體；UNC5C缺陷；結(jié)直腸腫瘤；相關(guān)性

UNC5同源蛋白(uncoordinated-5 homologue，UNC5H)是Netrin-1的一種依賴型受體，在缺少Netrin-1配體時，可誘導(dǎo)有關(guān)細胞凋亡，在與配體結(jié)合后通?？梢种频蛲?。而UNC5C作為UNC5H家族的一員，主要位于人類染色體4q21-q23。有研究報道，其廣泛表達于正常細胞中，但在大腸癌和其他腫瘤組織內(nèi)表達下降，表明UNC5C可發(fā)揮腫瘤抑制基因效果[1]。本文旨在研究UNC5C缺陷與大腸癌的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇河北省唐山市開灤總醫(yī)院腫瘤科54份散發(fā)性大腸癌及相關(guān)正常黏膜組織(石蠟標(biāo)本)，以及6個大腸癌細胞株(SW48、HCT116、DLD1、WiDr、LS174T、HT29)和纖維細胞株(fibroblast cell line，F(xiàn)CL)作研究對象。54份標(biāo)本均于該院從2012年2月到2013年3月行大腸癌手術(shù)的患者中部分切除所得。其中男34例，女20例；年齡32～83歲，平均(59.5±2.2)歲。結(jié)腸癌29例，直腸癌25例。54份標(biāo)本均由病理學(xué)證實?；颊咴谑中g(shù)前無放、化療及其他生物治療史。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 全部標(biāo)本均源于患者大腸癌組織(避免在腫瘤中心處的壞死區(qū)采集)及手術(shù)的切緣組織(取自標(biāo)本的近切端相應(yīng)切緣處)。標(biāo)本在離體之后快速置于-196 ℃的液氮內(nèi)冷凍，之后置于-85 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ａ砣〔糠纸M織放置在10%中性甲醛液內(nèi)固定并以石蠟包埋。

1.2.2主要儀器及試劑 儀器：德國 Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR儀；美國Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型電泳儀；美國Bio-Rad公司Sub-Cell GT 電泳槽；加拿大Carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝膠成像的分析系統(tǒng)；美國Thermo公司Ultro freeze 3410超低溫冰箱；中國寧波永新光學(xué)股份有限公司NIB-100型顯微鏡等。試劑：PCR擴增引物中各序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成；瓊脂糖產(chǎn)于美國的Promega公司；寶生物NucleoSpin?RNA 試劑盒；寶生物TEXPAT試劑盒；PBS液0.1 mol，pH為7.2～7.4；SP9000試劑盒；DAB顯色試劑盒等。

1.2.3檢測方法 對研究對象實施基因mRNA和甲基化分析，其中RNA提取使用寶生物NucleoSpin?RNA 試劑盒，石蠟標(biāo)本DNA提取使用寶生物TEXPAT試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進行仔細操作。根據(jù)RT-PCR實驗步驟對兩者行電泳分析，其中甲基化引物使用COBRA法并結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法。

1.2.4mRNA引物 UNC5A：上游引物為5′-TGA CCA CGG CCA ACT ACA CCT-3′，下游引物為5′-CCA GTG GGT GCA GTC CAG-3′，退火溫度55 ℃，擴增長度為142 bp，45個循環(huán)。UNC5B：上游引物為5′-CTG TCG GAC ACT GCC AAC TA-3′，下游引物為5′-CTG TCG GAC ACT GCC AAC TA-3′，退火溫度55 ℃，擴增長度為132 bp，45個循環(huán)。UNC5C：上游引物為5′-TGC AAA TGC TCG TGC TAC CT-3′，下游引物為5′-TGT GGT CCT TCT GAT GAA CCC-3′，退火溫度 55℃，擴增長度為258 bp，45個循環(huán)。Beta-actin：上游引物為5′-TCA CCA TGG ATG ATG ATA TCG CC-3′，下游引物為5，-CCA CAC GCA GCT CAT TGT AGA AGG-3′，退火溫度 55℃，擴增長度為294 bp，45個循環(huán)。

1.2.5甲基化引物 UNC5C：上游引物為5′-TTT AGT GGG GTT TTT AGT TGT TTG-3′，下游引物為5′-TAT CCC AAT CCC AAT CCR CAA C-3′，退火溫度(循環(huán)次數(shù))為56 ℃(5)，54 ℃(10)，52 ℃(30)，每次循環(huán)時間均為30 s；產(chǎn)物長度(酶)：125 bp(Hhal)酶37℃，12 h。

1.2.6測定標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)格按照SP9000、DAB顯色試劑盒說明書進行操作，PBS振洗、DAB顯色后觀察統(tǒng)計。于高倍鏡下對每一切片挑選10個代表視野，并對每個視野中100個癌細胞進行計數(shù)，共計1 000個細胞。陽性染色信號主要定位于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)為黃色顆粒，且界限清楚，并無明顯的背景著色。陽性計分標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)染色強度判定，0分為無色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為黃褐色。(2)根據(jù)陽性染色的細胞百分率判定，≤10%為0分；>10%～50%為1分；>50%～75%為2分；>75%為3分。此兩項得分所乘結(jié)果大于3分為陽性病例(記為+)，≤3分為陰性病例(記為-)，最后通過兩位資深病理醫(yī)務(wù)人員以雙盲法判定，所得一致意見即為最終結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1細胞株mRNA電泳及甲基化電泳結(jié)果 細胞株(SW48，HCT116，DLD1，WiDr，LS174T，HT29，F(xiàn)CL)mRNA電泳結(jié)果顯示，其中UNC5A除FCL外，其他指標(biāo)均有表達；UNC5B及Beta-actin各項指標(biāo)均有表達，但UNC5C除FCL有表達外，其他各項指標(biāo)均無表達(圖1)。細胞株UNC5C甲基化，大腸癌及正常組織的甲基化結(jié)果，見圖2、3。

2.2UNC5A、UNC5B及UNC5C在大腸癌細胞株及FCL中的表達比較 UNC5A和UNC5B的mRNA，在所檢測的大腸癌細胞株中均有表達。而UNC5C除FCL外，所有的癌細胞株中均無mRNA表達，見表1。

A：UNC5A；B：UNC5B；C：UNC5C；D：Beta-actin；1：SW48；2：HCT116；3：DLD1；4：WiDr；5：LS174T；6：HT29；7：FCL。

圖1 細胞株mRNA電泳結(jié)果

1：SW48；2：HCT116；3：DLD1；4：WiDr；5：LS174T；6：HT29。

圖2 細胞株UNC5C的甲基化結(jié)果

T：大腸癌；N：正常組織；M：標(biāo)記物。

圖3 大腸癌及正常組織的甲基化結(jié)果

表1 UNC5A、B、C的mRNA在兩種細胞株中的表達比較

2.3UNC5C在大腸癌組織及正常黏膜的甲基化情況比較 在大腸癌組織中UNC5C的甲基化明顯高于正常黏膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=52.90，P<0.05)。提示UNC5C mRNA表達的缺失可能和基因啟動子的甲基化有關(guān)，見表2。

表2 UNC5C在兩組組織中的甲基化比較[n(%),n=54]

a:P<0.05，與正常黏膜組比較。

2.4UNC5C甲基化與腫瘤進展關(guān)系 UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均顯著高于未甲基化水平，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示UNC5C基因甲基化于腫瘤早期即出現(xiàn)，且與腫瘤的進展程度無關(guān)，見表3。

表3 UNC5C甲基化與腫瘤進展關(guān)系[n(%)，n=54]

2.5UNC5C缺陷與大腸癌疾病的相關(guān)性分析 依照Spearman法進行相關(guān)性分析，UNC5C缺陷與大腸癌疾病呈正相關(guān)(r=0.856，P<0.05)。提示UNC5C在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

3 討 論

伴隨大腸癌疾病發(fā)展，患者癥狀會逐漸顯現(xiàn)，主要有腹痛、便血、腸梗阻以及腹部包塊等癥狀，加之腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤將導(dǎo)致受累器官發(fā)生變化，對患者身體造成嚴(yán)重影響[2-3]。UNC5H在人類群體中，主要即為UNC5A、C，編碼產(chǎn)物均為Ⅰ類跨膜蛋白，可由胞外區(qū)和跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)等功能區(qū)構(gòu)成[4]。

有資料表明，UNC5H在除神經(jīng)系統(tǒng)之外的其他大部分人體組織中均有表達[5]。雖然國內(nèi)外對于UNC5H在人體的表達有諸多報道，但關(guān)于UNC5C于大腸癌組織內(nèi)表達的報道則較為少見。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UNC5A和UNC5B的mRNA，在所檢測的大腸癌細胞株中均有表達。而UNC5C除FCL外，所有的癌細胞株中均無mRNA表達。在大腸癌組織中UNC5C的甲基化明顯高于正常黏膜，且UNC5C基因在大腸癌的Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均顯著高于未甲基化水平。表明UNC5C基因啟動子的甲基化狀況與UNC5C mRNA水平密切相關(guān)。同時，分析UNC5C基因啟動子的甲基化狀況與UNC5C mRNA水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，UNC5C缺陷與大腸癌疾病呈正相關(guān)，與Coissieux等[6]報道一致，這可能是因為UNC5C是一種條件性的抑癌基因，抑制腫瘤作用主要依賴于Netrin-1型配體，而后者常常僅局限在腸隱窩基底部位。Netrin-1存在時，UNC5C與之結(jié)合能夠阻止細胞產(chǎn)生凋亡，此過程可能有2個步驟：(1)阻斷Caspases切割受體胞內(nèi)區(qū)，在UNC5C受體和Netrin-1結(jié)合之后，可誘導(dǎo)受體發(fā)生二聚化，促使其胞內(nèi)區(qū)(含死亡域)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，最終阻斷Caspases切割。(2)觸發(fā)了抗凋亡的信號通路。對于配體缺乏區(qū)，UNC5C存在可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生凋亡，并直接促使細胞死亡及腫瘤退化。人類機體即可能利用此類機制對腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制。但對于大腸癌患者而言，UNC5C基因顯著減少或是缺失，細胞凋亡水平下降，但細胞增殖卻仍然較強，這就促使腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移變成了可能，因此在一定程度上導(dǎo)致了大腸癌疾病的發(fā)生和進展。

Hibi等[7]報道表明，人類大腸癌病患UNC5C基因的位點上含抑癌基因位點LOH，加之該基因常常會產(chǎn)生錯義突變，因此可能導(dǎo)致UNC5C表達減少。據(jù)統(tǒng)計，大于80%的直腸癌及大于49%的結(jié)腸癌患者機體中UNC5C的表達明顯減少，這無法單純依靠LOH加以解釋，但因Tanikawa等[8]已證實UNC5B基因為p53直接轉(zhuǎn)錄的目標(biāo)，可調(diào)節(jié)p53所誘導(dǎo)的有關(guān)細胞凋亡。而對于UNC5C和p53之間是否亦存在此種聯(lián)系，還需深入研究，有研究對諸多腫瘤患者研究后發(fā)現(xiàn)，p53活性缺失與UNC5C表達缺陷呈正相關(guān)，而UNC5C表達缺陷亦與大腸癌疾病本身呈正相關(guān)聯(lián)系[9-14]，與本文研究結(jié)果相一致，表明Netrin-1受體UNC5C缺陷與大腸癌具有一定相關(guān)性，值得臨床重視。

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Correlation analysis of methylation status of UNC5C gene promoter with colorectal cancer UNC5C*

SunDongsheng1,GaoChunyan1,WangZhigang2,LiuNing1,JiaFengjie1

(1.DepartmentofOncology,KailuanGeneralHospital,Tangshan,Hebei063000,China;2.CollegeofLifeScience,NeimengguUniversity,Huhehaote,Neimenggu010021,China)

Objective To investigate the correlation between methylation status of UNC5C gene promoter with colorectal cancer UNC5C.Methods 54 cases of sporadic colorectal cancer and related normal mucosal tissue,as well as 6 colon cancer cell lines and fiber cell lines(FCL) in the oncology department of the Kailuan General Hospital from February 2010 to March 2013 were selected as the research objects and performed the mRNA and methylation analysis for exploring the correlation between the netrin-1 receptor UNC5C defects with colorectal cancer disease.Results mRNA of UNC5A and UNC5B was expressed in the detected colorectal cancer cell lines.Except FCL for UNC5C,all of the cancer cell lines had no mRNA expression.In colorectal cancer tissue,UNC5C methylation was significantly higher than that in the normal mucosa,the difference was statistically significant (P<0.05).The methylation levels of UNC5C gene in the stage Ⅰ to Ⅱ,and the stage Ⅲ to Ⅳwere significantly higher than non-methylation levels,the differences were statistically significant (P<0.05).The correlation analysis by the Spearman method showed that the UNC5C defects was positively correlated with colorectal cancer disease (r=0.856,P<0.05).Conclusion Netrin-1 receptor UNC5C defect has certain correlation with colorectal cancer disease.

Netrin-1 receptor;UNC5C defects;colorectal neoplasms;relevance

·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.015

中國煤炭工業(yè)協(xié)會2012年度科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)性計劃項目(MTKJ 2012-420)。

孫冬生(1963-)，副主任醫(yī)師，博士研究生，主要從事基因甲基化與腫瘤關(guān)系研究。

R735.3

A

1671-8348(2015)11-1487-03

2014-07-08

2015-01-10)