狄婷婷，王秋杰，張 美，王瑞婷△

(1.承德醫(yī)學(xué)院研究生2012級；2.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院；3.承德市醫(yī)學(xué)情報(bào)站；4.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠腦神經(jīng)損傷的影響

狄婷婷1,2，王秋杰3，張 美4，王瑞婷4△

(1.承德醫(yī)學(xué)院研究生2012級；2.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院；3.承德市醫(yī)學(xué)情報(bào)站；4.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

目的 探討神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)大鼠腦神經(jīng)損傷的作用。方法將雄性Wistar大鼠20只，分為對照組和模型組，每組10只；模型組雙側(cè)海馬注射凝膠態(tài)Aβ(10 μg)，對照組注射生理鹽水；行水迷宮實(shí)驗(yàn)；硫堇染色觀察皮層神經(jīng)元形態(tài)變化及數(shù)量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平；免疫組化檢測膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP)表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)均明顯低于對照組(P<0.05)；皮層神經(jīng)元數(shù)量較對照組明顯減少(P<0.01)；血清中TNF-α、IL-1β明顯高于對照組(P<0.05)；海馬GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)。結(jié)論Aβ可激活膠質(zhì)細(xì)胞及促炎因子釋放，引起大鼠腦神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力降低。

阿爾茨海默??；淀粉樣蛋白；膠質(zhì)細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以認(rèn)知功能障礙及記憶減退或缺失為主要特征的退行性病變[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)作為AD發(fā)病的始動因子現(xiàn)已得到公認(rèn)[2]。AD患者腦內(nèi)持續(xù)存在慢性炎性反應(yīng)，參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞主要是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[3-5]。有研究認(rèn)為，長期使用非甾體類抗炎藥可使AD的發(fā)病率降低[6]，支持炎性反應(yīng)參與了AD的發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ的方法制作癡呆模型，觀察Aβ誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元損傷及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化，探討神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ引起神經(jīng)元損傷中的作用，為尋找AD治療新的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動物：選擇雄性Wistar大鼠20只，10～12周，體質(zhì)量(280±20)g，SPF級，購自北京華阜康生物技術(shù)科技有限公司(動物合格證號為0289310)。實(shí)驗(yàn)試劑：Aβ25～35購自Sigma公司，高效液相色譜法(HPLC)檢測純度大于或等于97%，Aβ25～351 mg干粉溶于500 μL無菌生理鹽水(2 g/L)，-20 ℃保存，臨用前置于37 ℃溫箱孵育3～5 d成凝膠態(tài)。大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(RRA00)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(RTA00)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由R&D研發(fā)中心提供，通用型SP工作液SP-9000免疫組化試劑盒、山羊抗兔神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP)多抗(G9269)、山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記(ZB2301,Lot:73399)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,其他試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 將20只大鼠分為模型組和對照組，每組10只。分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由食水，標(biāo)準(zhǔn)飼料。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，模型組大鼠雙側(cè)海馬各注射 5 μL凝膠態(tài)Aβ25～35(10 μg)，對照組大鼠雙側(cè)海馬各注射5 μL 0.9%生理鹽水溶液。14 d后行Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，21 d后將大鼠全部處死，心臟采血，大鼠腦組織固定，石蠟包埋。

1.2.2動物癡呆模型制作 大鼠腹腔注射4%的水合氯醛溶液(1 mL/100 g)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜，定位海馬(hippocampus)CA1區(qū)，按預(yù)試驗(yàn)確定進(jìn)針點(diǎn)進(jìn)針：前囟后(anteroposterior，AP)3.50 mm，中縫左或右(mediolateral,ML)±2.00 mm，顱骨硬腦膜平面向下(dorsoventral,DV)2.70 mm，微量注射器向雙側(cè)海馬緩慢注入Aβ25～35，留針5 min，緩慢拔針，縫合傷口，術(shù)后給予青霉素10萬U/只，每天1次，共3 d。

1.2.3Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 取高為60 cm的圓形不銹鋼水池，直徑為120 cm，將該水池等分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限的正中間放置一個(gè)高為23.50 cm，直徑為10.00 cm的圓形平臺，水溫為(21±1)℃；實(shí)驗(yàn)期間迷宮周圍參照物不變，迷宮上方安置攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。實(shí)驗(yàn)前需讓大鼠自由游泳2 min后，每天將大鼠從池壁4個(gè)象限點(diǎn)面向池壁放入水中，測驗(yàn)2次，6 d后撤去平臺，觀察大鼠在2 min內(nèi)通過平臺區(qū)的次數(shù)，并記錄大鼠在平臺象限內(nèi)停留的時(shí)間及所游路程等數(shù)據(jù)。

1.2.4血清制備及指標(biāo)檢測 取Wistar大鼠，每組10只，水合氯醛麻醉后，心臟取血，室溫下放置30 min，于4 ℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液，凍存于低溫冰箱。應(yīng)用ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5灌注取材 取血后，大鼠左心室快速灌注生理鹽水250 mL，然后灌注含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS-T)250 mL，先快后慢，1 h后斷頭取腦，左右半腦各在海馬注射部位沿冠狀面切開，4%多聚甲醛固定過夜，經(jīng)脫水、透明、浸蠟，將兩塊組織的切面朝下包埋，行冠狀切片，片厚5 μm，以備用于染色和免疫組化。

1.2.6硫堇尼氏體染色法 從石蠟標(biāo)本連續(xù)切片中每間隔4張抽取一張，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合，蒸餾水沖洗，0.2%硫堇60 ℃水浴30～60 min，冷卻后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.7細(xì)胞計(jì)數(shù)法 每組選取3只大鼠，每個(gè)標(biāo)本選取大鼠大腦皮層細(xì)胞損傷嚴(yán)重段2張切片，光鏡下觀察，每張隨機(jī)抽取大鼠大腦皮層切片的2個(gè)400倍視野，進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測膠質(zhì)細(xì)胞及GFAP表達(dá) 石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合，蒸餾水沖洗，PBS清洗3次；3%甲醇-H2O2去除過氧化物酶；95 ℃水浴抗原修復(fù)10～15 min，冷卻后PBS清洗；10%山羊血清封閉，37 ℃ 15 min；滴加GFAPⅠ抗(1∶80)，4 ℃過夜，PBS洗；滴加Ⅱ抗37 ℃ 孵育15 min，PBS洗；滴加親和素―生物素―過氧化物酶(ABC)復(fù)合物，37 ℃ 孵育15 min，PBS洗；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色；終止顯色；蘇木素復(fù)染；脫水，透明，封片，用PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞特異性分泌的一種酸性蛋白，切片中見到膠質(zhì)細(xì)胞突起呈棕黃色為GFAP蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 水迷宮實(shí)驗(yàn)6 d兩組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較，結(jié)果顯示，對照組的大鼠2 min內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)、在平臺象限停留的時(shí)間、在平臺象限所游路程與總路程比值，均明顯高于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)6 d兩組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較

a：P<0.05，與對照組比較。

2.2Aβ對大鼠皮層神經(jīng)元的影響 硫堇尼氏體染色，對照組大鼠皮層神經(jīng)元較多，神經(jīng)元形態(tài)清晰、完整，核仁清晰，突起明顯，膠質(zhì)細(xì)胞少；模型組大鼠皮層神經(jīng)元少，突起減少、斷裂，細(xì)胞體不完整，局部區(qū)域神經(jīng)元死亡(圖1)，膠質(zhì)細(xì)胞增多，可見膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元現(xiàn)象。模型組皮層神經(jīng)元(105.80±15.61)個(gè)明顯少于對照組(516.19±65.32)個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：模型組；B：對照組。

圖1 硫堇尼氏體染色大鼠皮層(×400)

2.3兩組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較 模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

組別TNF-αIL-1β對照組40.05±13.187.56±2.87模型組85.62±25.26a13.32±7.16a

a：P<0.05，與對照組比較。

A：模型組；B：對照組。

圖2 兩組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)(×400)

2.4兩組大鼠海馬GFAP表達(dá)結(jié)果比較 鏡下見模型組海馬膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組，同時(shí)模型組的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(17.50±8.62)個(gè)明顯高于對照組(8.21±6.10)個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組大鼠海馬GFAP表達(dá)，見圖2。

3 討 論

體外凝聚狀態(tài)的Aβ與AD患者腦內(nèi)的Aβ結(jié)構(gòu)相似，有研究表明Aβ25～35能引起神經(jīng)元損傷、學(xué)習(xí)、記憶能力下降[7-8]。本實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)海馬注射凝膠態(tài)Aβ25～35，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠皮層神經(jīng)元損傷、學(xué)習(xí)記憶能力降低，與文獻(xiàn)[9-10]的研究結(jié)果一致。有研究報(bào)道，AD患者腦內(nèi)變性的神經(jīng)元周圍有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生[11]，GFAP在激活的膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加，其表達(dá)與膠質(zhì)細(xì)胞活性成正比，表達(dá)增強(qiáng)標(biāo)志中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害時(shí)反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生[12-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠皮層局部區(qū)域神經(jīng)元死亡，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，可見膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元現(xiàn)象。模型組GFAP蛋白陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組，提示Aβ激活了膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞參與了Aβ引起的神經(jīng)元損傷。

AD是老年人常見的一種多因異質(zhì)性疾病，其病理表現(xiàn)多樣，涉及多種病理機(jī)制。其中老年斑形成是AD最具特征性的病理改變，有研究顯示，AD患者腦內(nèi)老年斑周圍存在大量活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和炎性因子，考慮AD患者腦內(nèi)持續(xù)存在慢性炎性反應(yīng)[3-5]，這種炎性反應(yīng)可能是導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)退行性病變的主要因素之一。宴燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清TNF-α、IL-1β水平顯著高于正常對照組，有研究報(bào)道，活化的膠質(zhì)細(xì)胞可釋放炎癥因子，引起神經(jīng)元損傷，本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血中TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組[16-17]。Takeuchi等[18]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)神經(jīng)毒性是通過激活的膠質(zhì)細(xì)胞自分泌谷氨酸鹽實(shí)現(xiàn)的，TNF-α、IL-1β一定程度上可反映癡呆嚴(yán)重程度，可能成為臨床輔助診斷的生物學(xué)指標(biāo)，高水平的TNF-α不僅對神經(jīng)元具有毒性作用，并且可協(xié)同IL-1強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生，加速病程的發(fā)展[19]。

綜合本實(shí)驗(yàn)神經(jīng)元損傷、GFAP表達(dá)和TNF-α、IL-1β水平，證實(shí)Aβ激活膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥因子釋放，損傷神經(jīng)元。慢性激活狀態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子在AD發(fā)病的不同環(huán)節(jié)可能起放大炎癥過程和細(xì)胞毒性作用。因此，AD患者通過抗炎藥物抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)，可能延緩病程的發(fā)展。

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Effect of glial cell on neuron damage induced by Aβ in Alzheimer′s disease rat*

DiTingting1,2,WangQiujie3,ZhangMei4,WangRuiting4△

(1.PostgraduateGrade2012,ChengdeMedicalUniversity;2.ChengdeNursingVocationalCollege;3.ChengdeMunicipalMedicalInformationStation;4.ChengdeMedicalUniversity,Chengde,Hebei067000,China)

Objective To explore the effect of glial cells on cerebral neuron damage induced by amyloid beta protein(Aβ) in Alzheimer′s disease rat.Methods 20 male Wistar rats were randomly divided into the control group and the model group,10 cases in each group The gel state Aβ(10 μg) was injected into the rat′s bilateral hippocampus in the model group,while the control group was injected with normal saline;the Morris water maze test was performed to assess the rat′s learning and memory ability;the thionine stain was used for observing the morphology and quantity of cerebral cortex neurons;the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to detect the serum tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and interleukin 1 beta(IL-1β) levels;the immunohistochemical was used to detect the expression of glial cell and glial fibrillary acidic protein (GFAP).Results The various indexes in the model group were significantly lower than those in the control group(P<0.05);the quantity of cerebral cortex neurons in the model group was significantly decreased compared with that in the control group(P<0.01);the ELISA results showed that the levels of TNF-α and IL-1β in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.05);the immunohistochemistry showed that the number of GFAP positive cells in the hippocampus in the model group was significantly more than that in the control group(P<0.05).Conclusion Aβ might activate the glial cells and promote the release of inflammatory cytokines,which causes the damage of rat cerebral neurons and leads to decrease the rat′s learning and memory ability.

Alzheimer disease;amyloid;glial cells;inflammation;glial fibrillary acidic protein

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.008

河北省高校省級重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(20130337)；河北省教育廳重點(diǎn)資助課題(ZD20131051)。

狄婷婷(1981-)，講師，碩士研究生，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制研究。

△通訊作者，Tel：(0314)2290069；E-mail：wrtwrt8324@sina.com。

R363.2

A

1671-8348(2015)11-1466-03

2014-08-24

2015-01-10)