李力，翟學佳

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

HPLC-MS/MS法測定人血漿頭孢克肟濃度的不確定度分析

李力，翟學佳

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

目的 探討高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法測定人血漿頭孢克肟濃度的不確定度。方法 對HPLC-MS/MS法測定血漿頭孢克肟濃度的全過程進行分析，包括測定重復性、稱量、標準溶液的配制、血漿樣本的處理、儀器、標準曲線擬合等，計算合成不確定度和擴展不確定度。結(jié)果 置信概率為95%時，血漿低(80 ng·mL-1)、中(560 ng·mL-1)、高(9 600 ng·mL-1)濃度頭孢克肟的擴展不確定度分別為14.93，23.65，137.95 ng·mL-1。結(jié)論 HPLC-MS/MS法測定血漿頭孢克肟濃度含量的不確定度主要由標準曲線的擬合、重復性及儀器允差引入。

頭孢克肟；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；血漿；不確定度

測量不確定度是目前國際社會普遍接受和推薦使用的定量說明測量結(jié)果質(zhì)量的一個參數(shù)，用于表征合理賦予被測量值的分散性；廣義上是指對測量結(jié)果正確性的可疑程度[1]。在生物樣本分析測試領(lǐng)域，測量不確定度與實驗室的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制密切相關(guān)[2-3]，其分析結(jié)果的可靠性直接決定了藥物安全性及有效性的評定，為此，有必要探討生物樣品檢測結(jié)果的不確定度。

筆者根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范和不確定度評定的相關(guān)資料，結(jié)合已發(fā)表的文獻[4-9]，對高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)法測定血漿頭孢克肟濃度的不確定度進行分析，找出影響不確定度的因素，對不確定度進行評估，最終得出測定結(jié)果擴展不確定度值，如實反映測量的置信度和準確度，對實驗結(jié)果的可信性、可比性和可接受性有非常重要的意義。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 頭孢克肟對照品(浙江食品藥品檢驗研究院，含量：87.4%，批號：090831)；內(nèi)標阿莫西林對照品(浙江食品藥品檢驗研究院，含量：86.9%，批號：20100607)；甲醇、乙腈，色譜純(美國Merck公司)；水為純化水；空白血漿來源于武漢市血液中心。

1.2 儀器 Agilent 1200型液相色譜系統(tǒng)：四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱(美國Agilent公司)；MS/MS系統(tǒng)：API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源(Turbo Ionspray)，美國Applied Biosystems公司；島津AUW-220D十萬分之一電子分析天平；混合器：XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；離心機：Thermo BR4i型高速離心機(法國Thermo公司)。實驗室用25 和10 mL量瓶，5 mL單標線移液管和5 mL分度吸量管(玻璃量器均為A級)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜/質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱：Ultimate C18柱(150 mm × 2.1 mm，5.0 μm)；流動相：乙腈：20 mmol·L-1乙酸胺(含0.3%甲酸)溶液=22：78；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：25 ℃；自動進樣箱溫度：4 ℃。

質(zhì)譜條件：離子檢測方式采用多反應離子檢測；離子極性：正離子；離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化；電噴霧電壓 ：5 500 V；離子源溫度 ：500 ℃；輔助氣1壓力 ：344.75 kPa，輔助氣2壓力：344.75 kPa；氣簾氣壓力：172.38 kPa；碰撞氣：41.37 kPa；入口電壓：10 V；出口電壓：10 V。頭孢克肟和內(nèi)標阿莫西林定量分析離子對以及各自的檢測條件見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 頭孢克肟標準系列溶液的配制 精密稱取鹽酸頭孢克肟對照品11.44 mg(含頭孢克肟10 mg)置50 mL量瓶，用流動相溶解并稀釋至刻度，配得200 μg·mL-1頭孢克肟母液。分別用流動相依次稀釋配制成含頭孢克肟120 000(C1)，40 000(C2)，15 000(C3)，5 600(C4)，2 400(C5)，800(C6)，300(C7)ng·mL-1的系列標準曲線溶液和含頭孢克肟800(低)，5 600(中)，96 000(高)ng·mL-1的質(zhì)控標準溶液。溶液配制過程中需用到10 mL量瓶、5 mL單標線移液管和5 mL分度吸量管。

2.2.2 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取阿莫西林對照品11.51 mg(含阿莫西林10 mg)，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到1.0 mg·mL-1阿莫西林儲備液，置于4 ℃冰箱保存。用5 mL移液管取阿莫西林儲備液4 mL定容至100 mL，得40 μg·mL-1的內(nèi)標工作液。以上各儲備液及標準系列溶液均用經(jīng)過校正的量瓶配制，在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理 精密吸取血漿樣本200 μL，置于1.5 mL Ep管中，精密加入內(nèi)標溶液20 μL，渦旋10 s后，加入甲醇0.6 mL，渦旋1 min，然后于21 100×g離心10 min，吸取上清液置于進樣瓶中。

2.4 測定和計算 取“2.3”項處理后的上清液5 μL進行HPLC-MS/MS 分析，測定計算頭孢克肟的峰面積As和內(nèi)標峰面積Ai的比值R(R=As/Ai)。以峰面積比值(R)對血藥濃度(C)進行加權(quán)最小二乘法線性擬合，得標準曲線回歸方程。樣品用同樣的方法分析后，代入回歸方程，計算待測血漿中頭孢克肟濃度。數(shù)據(jù)采集分析使用Analyst 1.5.1版軟件(美國Applied Biosystems公司)。

2.5 校準 儀器在使用前用標準物質(zhì)聚丙二醇進行一次校準，表明儀器運行正常。分析樣品時，每天做隨行標準曲線進行校準。

2.6 數(shù)學模型的建立

標準曲線公式：R=a×C+b

血漿中頭孢克肟濃度計算公式：C=(R-b)/a

其中：a為標準曲線回歸方程斜率，b為標準曲線回歸方程截距，R為頭孢克肟與內(nèi)標峰面積之比，C為頭孢克肟最終血漿測得濃度。

2.7 不確定度分析

2.7.1 分析不確定度分量 根據(jù)實際前處理方法，不確定度來源主要有操作重復性、天平稱量、量瓶、移液管、標準溶液配制、標曲擬合、HPLC-MS/MS儀器等因素，上述影響見圖1。

2.7.2 測定結(jié)果的A類不確定度評定 重復性引起的不確定度用A類評定程序。平行配制濃度為濃度為80，560，9 600 ng·mL-1的質(zhì)控樣本各5份，共配制3批，結(jié)果見表2。

一次測量的標準偏差的貝塞爾公式為：

S1(x，L)=1.966 ng·mL-1

S2(x，L)=2.022 ng·mL-1

S3(x，L)=1.334 ng·mL-1

低濃度(L)15次測定結(jié)果的標準不確定度為：

表1 頭孢克肟和內(nèi)標的檢測條件

試藥監(jiān)控離子對(相對分子質(zhì)量)采集時間/ms去簇電壓/V碰撞能量/eV保留時間/min頭孢克肟454.1/285.0520060212.06±0.3阿莫西林366.05/249.0520060152.40±0.3

圖1 不確定度來源分析圖

表2 頭孢克肟樣品重復測定結(jié)果Tab.2 Determination results on the repeatability of cefixime detection ng·mL-1

測定結(jié)果的相對標準不確定度為：

同法計算中濃度和高濃度相對標準不確定度為：Urel(1，M)=0.016 0；Urel(1，H)=0.003 9。

2.7.3 測定結(jié)果的B類不確定度評定

2.7.3.1 天平稱量頭孢克肟及內(nèi)標時引入的不確定度 采用B類評定。用十萬分之一電子天平，可自動減皮重。

數(shù)學模型y=m+△0+△

其中m為透明部分，△0為由自動調(diào)零引起的誤差，△為天平的非線性誤差。

自動調(diào)零作為一次扣皮重，其a0=a，則自動調(diào)零引起的標準測量不確定度為：U(△0)=a0/k0=0.002 9 mg

不考慮重復性誤差時，天平的標準不確定度：

Uc(x)=0.050 mg

頭孢克肟和內(nèi)標稱量相對標準測量不確定度分別為(x1，x2分別為頭孢克肟和內(nèi)標稱量值)：

Urel(x1)=Uc/x1=0.003/10=0.000 3

Urel(x2)=Uc/x2=0.003/10=0.000 3

2.7.3.2 標準溶液配制引入的測量不確定度 采用B類評定程序。配制儲備液及標準溶液中用到的量瓶容積為100 mL，其允差為0.1 mL，25 mL量瓶允差為0.03 mL。5 mL移液管和10 mL移液管允差分別為0.015和0.020 mL。

Urel(3)=

2.7.3.3 樣品不均勻性引起的測量不確定度 用B類評定程序，因為樣品均為液態(tài)，并充分渦旋混合，可忽略不計由此帶來的不確定度。

2.7.3.4 標準曲線擬合過程中引入的不確定度 采用B類評定程序。 以待測物濃度(X)為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值(Y)為縱坐標，采用加權(quán)(權(quán)重為1/X2)最小二乘法進行線性回歸，共擬和3條標準曲線，斜率和截距見表3。

表3 各擬合標準曲線的參數(shù)Tab.3 Parameters of calibration curves

共3條標準曲線，7種濃度，共測定21次。

Y=a+bX，誤差方程為：vi=yi-(axi+b)

∑vi2=∑[yi-(axi+b)]2

按前述樣品處理方法處理高、中、低3種濃度質(zhì)控樣品各15個，平均濃度：XL=73.89 ng·mL-1，XM=537.20 ng·mL-1，XH=8 897.33 ng·mL-1。標準測量不確定度為：

P為測定X的總次數(shù)(P=15)

N為測定對照品血漿的總次數(shù)(N=3×7=21)

a為標準曲線斜率

b為標準曲線截距

標準曲線對于高、中、低3種濃度的相對標準測量不確定度為：

低濃度：Urel，L(4)=7.45/73.89=0.100 8

中濃度：Urel，M(4)=7.28/537.20=0.013 6

高濃度：Urel，H(4)=9.52/8 897.33=0.001 1

2.7.3.5 儀器測量不確定度 所用儀器為API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，其定量允差為1%，其相對標準不確定度為：

2.7.3.6 溫度引起的相對不確定度 由于藥物和內(nèi)標都是在相同的溫度環(huán)境下測定的，因此溫度對濃度的影響引起的不確定度可以忽略不計。

2.7.3.7 對照品含量引起的測量不確定度 對照品未提供不確定度，視為真實值，引入不確定度為零。

2.8 各不確定度分量的統(tǒng)計直方圖 見圖2～4。

圖2 低濃度不確定度分量的統(tǒng)計直方圖

Fig.2 Histogram of uncertainty components at low concentration

圖3 中濃度不確定度分量的統(tǒng)計直方圖

Fig.3 Histogram of uncertainty components at middle concentration

2.9 標準不確定度的合成 根據(jù)不確定度傳播率對以上各相對不確定度進行合成：

低、中、高濃度各自的合成相對標準測量不確定度

圖4 高濃度不確定度分量的統(tǒng)計直方圖

Fig.4 Histogram of uncertainty components at high concentration

分別為：Uc，rel，L=0.101 1，Uc，rel，M=0.022 0，Uc，rel，H=0.007 5。

3種濃度測定的合成標準測量不確定度分別為：Uc，L=0.1011×73.89=7.47 ng·mL-1，Uc，M=0.022 0×537.20=11.83 ng·mL-1，Uc，H=0.00 75×8 897.33=68.98 ng·mL-1。

擴展不確定度，取k=2，P=95%，簡易評定：UL=k×7.47=14.93 ng·mL-1，UM=k×11.83=23.65 ng·mL-1，UH=k×68.98=137.95 ng·mL-1。

血漿中頭孢克肟不同濃度質(zhì)控測定結(jié)果分別為：低濃度(73.89±14.93) ng·mL-1，中濃度(537.20±23.65) ng·mL-1，高濃度(8 897.33±137.95) ng·mL-1，k=2，P=95%。

3 討論

血漿中頭孢克肟含量的HPLC-MS/MS法測定過程中，分析各測量不確定度分量，線性擬合過程對低質(zhì)控樣本不確定度的貢獻最大。對于中、高濃度依次是重復性和儀器測量引起的不確定度。由結(jié)果可知，對測定結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素為標準曲線的擬合、重復性及儀器允差等因素。在實際操作過程中，需著重注意這些影響因素，并采取相應的措施，將測量結(jié)果的不確定度進一步減小。

測定過程中涉及到的樣品(標準溶液、血漿)均為液態(tài)樣品，且充分混勻，樣品不均勻度很小，故樣品不均勻性引入的不確定度非常小，可忽略此部分的不確定度。實驗環(huán)境溫度相對恒定(控制在約20 ℃)，溫度對于測定結(jié)果的影響較小，可忽略不計。

不確定度對于優(yōu)化實驗方法和控制實驗質(zhì)量具有重要的意義。生物樣本基質(zhì)成分復雜，處理步驟繁瑣，干擾因素較多，不確定度評定較為困難。筆者對HPLC-MS/MS法測定血漿中頭孢克肟的不確定度進行分析，找出影響不確定度的因素，對不確定度進行評估，如實反映測量的置信度和準確度，為方法學研究提供參考。

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Uncertainty of Measurement for Cefixime in Human Plasma by HPLC-MS/MS

LI Li，ZHAI Xuejia

(DepartmentofPharmacy，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China)

Objective To develop a method on evaluating the uncertainty during the determination of cefixime in human plasma by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods We analyzed various factors that can cause the uncertainty in the whole process of determination,which includ repeatability，weighting，preparation of standard solutions，sample preparation，equipment error and calibration curve fitting.The expanded uncertainty was evaluated by calculating uncertainty of each component and combined. Results The expanded uncertainty for low (80 ng·mL-1)，medium (560 ng·mL-1) and high (9 600 ng·mL-1) level of cefixime was 14.93，23.65，137.95 ng·mL-1，respectively (P=95%). Conclusion The uncertainty of determining cefixime in human plasma by HPLC-MS/MS is mainly caused by the calibration curve fitting，repeatability and HPLC-MS/MS error.

Cefixime; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Plasma; Uncertainty

2014-04-04

2014-10-10

李力(1982-)，女，湖北襄陽人，藥師，碩士，研究方向：臨床藥理。電話：027-85726073，E-mail：dsywp@163.com。

翟學佳(1983-)，女，湖北武漢人，主管藥師，碩士，研究方向：臨床藥理和藥物分析。電話：027-85726073，E-mail：zhaixuejia@163.com。

R978.11；R969.1

A

1004-0781(2015)09-1150-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.007