王曉峰，周建

(浙江省江山市人民醫(yī)院藥劑科，江山 324100)

齊墩果酸對胰島素抵抗HepG2關(guān)鍵酶活性的影響

王曉峰，周建

(浙江省江山市人民醫(yī)院藥劑科，江山 324100)

目的 探討齊墩果酸對胰島素抵抗人肝癌細胞(HepG2)關(guān)鍵酶活性的影響。方法 將HepG2細胞分別設(shè)正常對照組、模型對照組、二甲雙胍組、齊墩果酸組。采用肝糖原測定試劑盒檢測齊墩果酸對胰島素抵抗HepG2 細胞糖原含量的影響；采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶耦聯(lián)比色法、乳酸脫氫酶耦聯(lián)比色法及鉬酸銨定磷法測定葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性。結(jié)果 齊墩果酸能夠促進胰島素抵抗HepG2 細胞的葡萄糖消耗，使G-6-Pase 及PEPCK 活性分別降低54.8%，18.8%，使GK 活性和糖原含量分別升高100.6%，98.6%。結(jié)論 齊墩果酸可降低胰島素抵抗HepG2 細胞G-6-Pase 和PEPCK 的活性，抑制糖異生，從而減少細胞內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。齊墩果酸可提高GK 活性，加快糖酵解，增加糖原含量，減輕HepG2 細胞的胰島素抵抗狀態(tài)。

齊墩果酸；胰島素抵抗；肝癌細胞；葡萄糖激酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；葡萄糖-6-磷酸酶

齊墩果酸作為一種肝病輔助藥物，已在臨床廣泛應(yīng)用。近年來，研究報道其具有降血糖的作用，謝靈璞[1]報道齊墩果酸能升高高血糖大鼠血清胰島素水平，增加肝糖原含量；洪峰等[2]報道齊墩果酸可以改善糖尿病大鼠糖耐量，增加肝糖原含量；柳占彪等[3]報道齊墩果酸能提高四氧嘧啶所致高血糖大鼠的肝糖原含量，但作用機制均未闡明。以上報道共同的特點是齊墩果酸具有提高肝糖原含量的作用，筆者在此基礎(chǔ)上研究齊墩果酸對胰島素抵抗(insulin resistance，IR)人肝癌細胞株(HepG2)細胞關(guān)鍵酶的活性，初步闡述增加肝糖原含量的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HpeG2細胞由上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司提供；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為Sigma公司產(chǎn)品(批號：M2128)；糖原(批號：20131205)、葡萄糖激酶(glucokinase，GK，批號：20131210)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PEPCK，批號：20131212)、6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase，批號：20131210)均購自南京建成生物科技有限公司；二甲雙胍(批號：1301074)由中美上海施貴寶制藥有限公司提供；齊墩果酸(每片20 mg，批號：0502)由九芝堂股份有限公司提供。

1.2 IR-HepG2模型建立 將HepG2細胞用含15%胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)調(diào)整細胞密度為105個·mL-1，按每孔800 μL轉(zhuǎn)入96孔板中。待細胞單層貼壁后，更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12 h。待細胞適應(yīng)無血清的環(huán)境后再將培養(yǎng)液移出，加入新配制的含有10-8mol·L-1胰島素的培養(yǎng)液，并設(shè)胰島素的空白孔，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中孵育36 h[4]。檢測培養(yǎng)液上清液的葡萄糖含量，并計算各組細胞的葡萄糖消耗量。

1.3 藥物干預(yù) 將HepG2細胞棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后分別設(shè)正常對照組、模型對照組、二甲雙胍(0.001 mol·mL-1)組、齊墩果酸(0.125，0.250，0.500 mol·mL-1)組，每組8個復(fù)孔。藥物作用24 h后停止。

1.4 糖原含量的測定 按肝糖原測定試劑盒方法檢測。

1.5 GK的測定 將HepG2細胞制成勻漿后，在高速離心機12 000 r·min-1(r=5 cm)離心15 min，上清液用于酶活性測定。

1.6 PEPCK的測定 將HepG2細胞制成勻漿后，在高速離心機12 000 r·min-1(r=5 cm)離心15 min，上清液用于酶活性測定。

1.7 G-6-Pase的測定 將HepG2細胞制成勻漿后，在高速離心機12 000 r·min-1(r=5 cm)離心30 min，上清液用于酶活性測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0版進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對肝糖原含量的影響 正常對照組、模型對照組、二甲雙胍(0.001 mol·mL-1)組、齊墩果酸(0.125，0.250，0.500 mol·mL-1)組肝糖原含量分別為(8.66±1.32)，(4.21±1.00)，(8.56±1.25)，(4.53±1.22)，(5.74±0.98)，(8.36±1.06) μg·mL-1。 與正常對照組比較，模型對照組肝糖原含量降低51.4%(t=3.25，P<0.01)。藥物作用24 h后，與模型對照組比較，齊墩果酸大劑量組與中劑量組肝糖原含量分別升高98.6%和36.3%(t=3.56，4.69，P<0.01)，二甲雙胍組糖含量增加103.3%(t=3.48，P<0.01)。

2.2 對GK、PEPCK、G-6-Pase的影響 與正常對照組比較，模型對照組GK活性下降66.5%(t=3.95，P<0.01)。藥物作用24 h后，與模型對照組比較，齊墩果酸0.500 mol·mL-1組GK活性升高100.6%(t=4.05，P<0.01)，二甲雙胍組GK活性升高146.4%(t=3.82，P<0.01)，見表1。

與正常對照組比較，模型對照組PEPCK活性升高110.3%(t=4.36，P<0.01)。藥物作用24 h后，與模型對照組比較，齊墩果酸0.500 mol·mL-1組PEPCK活性降低18.8%(t=2.56，P<0.05)，而二甲雙胍組PEPCK活性降低30.3%(t=4.21，P<0.01)，見表1。

與正常對照組比較，模型對照組細胞G-6-Pase活性升高143.1%(t=5.26，P<0.01)。藥物作用24 h后，與模型對照組比較，齊墩果酸0.500 mol·mL-1組G-6-Pase活性降低54.85%(t=3.09，P<0.01)，二甲雙胍組G-6-Pase活性降低52.5%(t=4.24，P<0.01)，見表1。

3 討論

IR是2型糖尿病的重要特征，1995年STERN[5]提出了著名的共同土壤學(xué)說，認為糖尿病、高血壓及冠心病是在IR這個共同土壤中“生長”出來的，即IR是這些疾病的共同危險因素。而肝臟及外周組織是胰島素作用的靶組織，是IR 產(chǎn)生的主要部位。肝臟對葡萄糖代謝起著重要的作用，糖異生增加和糖酵解減少引起的肝糖原生成增多，可導(dǎo)致2型糖尿病患者空腹高血糖[6]。本研究中的HepG2 細胞來源于肝細胞，是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，保留了肝細胞的許多生物學(xué)特性[4]，在高水平的胰島素條件下，HepG2細胞表面胰島素受體的數(shù)目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)[7]。故本研究選擇HepG2 細胞建立IR 的細胞模型。已有研究報道0.2 g·L-1齊墩果酸可改善人肝癌細胞IR模型的IR[6]。

表1 4組細胞GK、PEPCK、G-6-Pase活性比較

與正常對照組比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normol control group，*1P<0.01，*4P<0.05；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

筆者研究的關(guān)鍵酶G-6-Pase和PEPCK 是肝糖異生的限速酶，G-6-Pase催化糖異生和糖原分解的最后一步反應(yīng)，而PEPCK 在催化丙酮酸、成糖氨基酸和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物異生為糖的生化過程中起著重要作用。GK 是糖酵解的第一個關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸，促進細胞對葡萄糖的利用[8]。

本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型對照組細胞糖原含量降低，GK活性下降，PEPCK活性降低，G-6-Pase活性升高(P<0.01)。藥物作用24 h后，與模型對照組比較，齊墩果酸大、中劑量組細胞肝糖原含量均升高(P<0.01)；齊墩果酸組細胞GK活性升高(P<0.01)，PEPCK活性均降低(P<0.05)，G-6-Pase活性降低(P<0.01)。

綜上所述，齊墩果酸可降低胰島素抵抗HepG2 細胞G-6-Pase和PEPCK的活性，抑制糖異生作用，從而減少細胞內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。此外，齊墩果酸還可提高GK活性，加快糖酵解，增加糖原含量，減輕HepG2細胞的IR狀態(tài)。

[1] 謝靈璞.齊墩果酸對高血糖大鼠胰島素及肝糖原含量的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(7)：1669-1671.

[2] 洪峰，胡靜娜.齊墩果酸對糖尿病大鼠糖耐量及肝糖原的影響[J].海峽藥學(xué)，2013，25(2)：27-29.

[3] 柳占彪，張小平，胡剛.齊墩果酸對四氧嘧啶性高血糖大鼠肝糖原含量的動態(tài)研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012，8(10)：29-30.

[4] 張汝學(xué)，賈正平，李茂星，等.體外胰島素抵抗細胞模型的建立及藥物篩選的應(yīng)用[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(7)：971-976.

[5]STERN M P.Diabetes and cardiovascular disease，the “common soil” hypothesis[J].Diabetes，1995，44(4)：369-374.

[6] 劉志霞，韓淑英，李繼安.人肝癌細胞胰島素抵抗模型建立及有效中藥成分的篩選[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(28)：5241-5244.

[7] WILLIAMS J F，OLEFSKY J M.Defecetive insulin receptor function in down-regulated HepG2 cell[J].Endocrinology，1990，127(4)：1706-1717.

[8] 韋乃球，楊柯，洗寒梅，等.白子菜水提液對胰島素抵抗HepG2細胞關(guān)鍵酶活性的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(3)：281-284.

Effect of Oleanic Acid on Key Enzyme Activity in Insulin-Resistant HepG2 Cell Line

WANG Xiaofeng，ZHOU Jian

(DepartmentofPharmacy，thePeople’sHospitalofJiangshanCity，ZhejiangProvince，Jiangshan324100，China)

Objective To explore the effect of oleanic acid on key enzyme activity in insulin-resistant HepG2 cells. Methods The HepG2 cells were divided into normal control，model control，metformin，and oleanic acid groups.Glycogen content in insulin-resistant HepG2 cell model were detected by hepatic glycogen test kit upon treatment with oleanic acid.Activities of glucokinase ( GK) ，phosphoenolpyruvate carboxylase kinase (PEPCK)，and glucose-6-phosphatase (G-6-Pase) were assayed by the glucose 6-phosphate dehydrogenase coupling colorimetric，lactate dehydrogenase coupling colorimetric and ammonium molybdate constant phosphorus methods. Results The oleanic acid enhanced glucose consumption，lowered the activity of G-6-Pase and PEPCK by 54.8% and 18.8%，respectively，and increased the activity of GK and glycogen content in also insulin-resistant HepG2 cells by 100.6% and 98.6%，respectively. Conclusion The oleanic acid play a role in lowering PEPCK and G-6-Pase activities and inhibiting glucogenesis，resulting in the reduction of endogenous glucose in the cell.In addition，it can augment the activity of GK，accelerate the process of glucolysis，increase the glycogen content，and alleviate insulin resistance of HepG2.

Oleanic acid; Insulin resistance； Hepatocellular carcinoma cells; Glucokinase ; Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase ; Glucose-6-phosphatase

2014-03-24

2014-07-18

王曉峰(1972-)，男，浙江江山人，主管藥師，學(xué)士，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：(0)13867005578，E-mail：1720382207@qq.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)09-1139-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.004