潘珍珍+潘陳為+諸葛璐+陳永平+周光耀+林巍+金玲湘

[摘要] 目的 探討肝臟組織中程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）表達(dá)在慢性HBV攜帶者病情進(jìn)展中的作用。 方法 選擇慢性HBV攜帶者病例50例為研究對(duì)象，均予以血生化、病毒DNA、肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)；患者肝穿刺活檢后肝臟組織進(jìn)行病理HE染色，觀察肝臟組織炎癥和纖維化的表現(xiàn)，并根據(jù)炎癥結(jié)果將50例分為：A組：炎癥0級(jí)；B組： 炎癥≥1級(jí)。免疫組化檢測(cè)肝組織PD-1表達(dá)。 結(jié)果 根據(jù)炎癥結(jié)果病例分為兩組：A組26例（炎癥G0）和B組24例（炎癥≥G1）。病理分級(jí)炎癥≥G2或纖維化≥S2的例數(shù)為15例。兩組患者4種血清肝纖維化指標(biāo)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與A組比較，B組肝臟PD-1表達(dá)水平明顯高（P<0.05）。PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果呈正相關(guān)。 結(jié)論 慢性HBV攜帶者肝臟組織PD-1表達(dá)水平越高，炎癥及纖維化進(jìn)展的可能性越大，肝臟PD-1表達(dá)可作為慢性HBV攜帶者病程進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞] 慢性HBV攜帶者；肝臟；纖維化；程序性死亡分子1

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）34-0008-03

臨床上，慢性HBV攜帶者為處于慢性乙肝病毒感染的免疫耐受期，雖定期檢查肝功能，結(jié)果往往在正常范圍，CT、B超等影像學(xué)檢查亦無(wú)明顯異常發(fā)現(xiàn)，疾病的進(jìn)展具有“隱蔽性”。隨著病程的延長(zhǎng)，雖然其生化指標(biāo)持續(xù)在正常范圍，但肝臟組織學(xué)的損傷已逐漸出現(xiàn)，甚至有研究報(bào)道HBV DNA高載量水平的慢性HBV攜帶者具有一定的肝硬化、肝癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此對(duì)于HBV攜帶者的肝臟損傷、纖維化評(píng)估以及早期針對(duì)性藥物干預(yù)具有非常重要的臨床意義。但是，目前對(duì)于此類患者肝臟損傷整體評(píng)估以及預(yù)測(cè)肝炎活動(dòng)發(fā)生缺乏有效手段。PD-1是一種抑制性共刺激分子，在維持外周耐受中起關(guān)鍵性的作用，既往研究中描述了其在慢性病毒感染、腫瘤免疫及自身免疫性疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[2-4]。更有研究發(fā)現(xiàn)其在乙肝病毒清除過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控的作用，與HBV慢性感染密切相關(guān)[5]。本研究旨在對(duì)慢性HBV攜帶者進(jìn)行肝活檢，檢測(cè)肝臟組織中PD-1表達(dá)，并進(jìn)一步探索其在慢性HBV攜帶者病程進(jìn)展中的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年11月1日～2013年2月5日在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染內(nèi)科行肝穿刺活檢術(shù)的慢性HBV攜帶者，納入研究50例，男32例，女18例，年齡20～45歲，均無(wú)臨床癥狀，肝臟影像學(xué)無(wú)明顯異常，無(wú)其他慢性疾病史。慢性HBV攜帶者診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年12月修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。

1.2試劑

PD-1小鼠抗人單克隆抗體、二抗試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

所有病例均行HBV血清標(biāo)志物、HBV DNA定量、肝纖維化血清指標(biāo)檢測(cè)。血清肝功能檢查采用LX20PRO（Beckman coulter公司）全自動(dòng)生物化學(xué)檢測(cè)儀；血清乙肝免疫采用北京萬(wàn)泰生物技術(shù)公司ELISA試劑盒，HBV DNA檢測(cè)采用深圳匹基生物工程股份有限公司試劑盒。

1.4 肝穿刺

所有病例均無(wú)肝穿刺禁忌證。B超定位下快速經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)，每例患者穿刺2條肝臟條索組織，肝穿刺標(biāo)本長(zhǎng)度不短于1.5 cm，內(nèi)徑不小于1 mm。

1.5 病理學(xué)檢查

肝穿刺獲得的肝臟條索組織用10%中性甲醛固定，之后依次石蠟包埋、切片，行HE染色；由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬二院病理科2名專家閱片，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南》[6]，評(píng)定標(biāo)本的炎癥分級(jí)（G）和纖維化分級(jí)（S）。根據(jù)病理炎癥結(jié)果將50例病例分為兩組：A組：炎癥G0；B組：炎癥≥G1。

1.6 免疫組化檢測(cè)肝臟組織PD-1表達(dá)

石蠟切片脫蠟、水化，3%雙氧水孵育，雙蒸水沖洗，PBS浸泡，枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)，PBS沖洗，血清封閉，室溫孵育后傾去血清，滴加PD-1一抗工作液，37℃孵育，PBS沖洗后滴加二抗工作液，37℃孵育，PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記SP工作液，37℃孵育，PBS沖洗，之后DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水、透明、封片。用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0重復(fù)3次讀取每張片的陽(yáng)性區(qū)域的吸光度值，取平均值作為蛋白的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料組間比較t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析使用非參數(shù)檢驗(yàn)Spearman（斯伯曼/斯皮爾曼）法分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清標(biāo)志物和病毒學(xué)指標(biāo)

50例患者肝功能在正常范圍，ALT（31.20±11.81）U/L，均為HBeAg（+），HBV DNA：10^5～10^8拷貝/mL。病理學(xué)結(jié)果見(jiàn)表1。并根據(jù)炎癥結(jié)果分為兩組：A組26例（炎癥G0）和B組24例（炎癥≥G1）。A組病例中S2分級(jí)的6例，B組病理中S2分級(jí)的6例，S3分級(jí)的有3例，病理分級(jí)炎癥≥G2或纖維化≥S2的例數(shù)為15例。

2.2 血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

A組和B組患者4種血清肝纖維化指標(biāo)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表2）。

2.3 免疫組化檢測(cè)肝臟組織PD-1表達(dá)結(jié)果

A組患者肝臟組織PD-1平均光密度值為（1.56±0.39），B組為（2.87±0.62）。B組患者肝臟組織PD-1表達(dá)水平明顯高于A組（t=9.05，P<0.05）。50例患者纖維化S0級(jí)（11例）PD-1平均光密度值為（1.86±0.52），纖維化S1級(jí)（24例）PD-1平均光密度值為（2.07±0.69），纖維化S2級(jí)（12例）PD-1平均光密度值為（2.58±0.65），纖維化S3級(jí)（3例）PD-1平均光密度值為（2.82±0.15）。

2.4 PD-1與肝纖維化相關(guān)性分析

PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.356，P=0.011<0.05。PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為rs=0.780，P=0.000<0.05。

3 討論

乙肝病毒感染是我國(guó)最常見(jiàn)的肝臟感染性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，而其中慢性HBV攜帶者占了很大的比重[6]。慢性HBV攜帶者，經(jīng)各項(xiàng)檢查如肝功能以及CT、B超等影像學(xué)檢查往往無(wú)明顯異常的發(fā)現(xiàn)。但是，近年來(lái)愈來(lái)愈多的研究提示，乙肝進(jìn)展具有“隱蔽性”，許多ALT正常的慢性HBV感染患者，同樣存在肝損害，部分患者病變程度在G2、S2以上，甚至進(jìn)展到早期肝硬化階段[7，8]。本研究中也同樣存在這樣的情況，50例患者雖肝功能均正常范圍，影像學(xué)亦無(wú)明顯異常，但病理分級(jí)炎癥≥G2或纖維化≥S2的例數(shù)為15例。

PD-1是一種抑制性共刺激分子，在維持外周耐受中起著關(guān)鍵性的作用。既往的研究表明，PD-1與病毒感染后病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能衰竭及免疫耐受有關(guān)，其抑制病毒的清除，有助于病毒感染的慢性化[9]；Tao等[10]使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)37例慢性丙肝病毒感染患者與17例正常健康者的血標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙肝病毒慢性感染者CD8+淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)強(qiáng)度及百分比均較高于正常組。

研究也發(fā)現(xiàn)PD-1在乙肝病毒清除過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，與HBV慢性感染密切聯(lián)系[5，11]。免疫耐受是HBV感染慢性化的主要機(jī)制，PD-1通過(guò)切斷自身反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受，并抑制效應(yīng)性T細(xì)胞維持免疫耐受[12]。因此，HBV的持續(xù)感染與PD-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。隨著對(duì)PD-1研究的深入，更有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中PD-1表達(dá)與炎癥程度具有相關(guān)性。韋麒等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著炎癥活動(dòng)度的加重，PD-1的表達(dá)也更為顯著。但是目前對(duì)于慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)的臨床研究鮮有報(bào)道。

本研究納入50例慢性HBV攜帶者，肝穿刺活檢后病理染色，并進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)肝臟組織PD-1表達(dá)肝臟組織，并根據(jù)炎癥結(jié)果分為兩組：A組26例（炎癥G0）和B組24例（炎癥≥G1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B組患者肝臟組織PD-1表達(dá)水平明顯高于A組（P<0.05），也證明了在慢性HBV攜帶者，肝臟組織炎癥程度影響PD-1的表達(dá)。有學(xué)者認(rèn)為[13]，PD-1的表達(dá)增強(qiáng)使得免疫功能受到抑制，以避免持續(xù)活化的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝臟過(guò)度受損而引發(fā)功能進(jìn)一步惡化，但同時(shí)也使T細(xì)胞功能低下而不利于機(jī)體清除病毒，導(dǎo)致感染的慢性持續(xù)。因此，PD-1表達(dá)上調(diào)是機(jī)體在肝臟炎癥反應(yīng)加劇時(shí)的一個(gè)自我保護(hù)調(diào)節(jié)，也可以推斷在機(jī)體對(duì)乙肝病毒免疫應(yīng)答與免疫介導(dǎo)的肝臟損害中，PD-1表達(dá)可能起到平衡的作用。本研究對(duì)慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.780，P<0.05）。

近年研究表明，PD-1過(guò)度表達(dá)與多種臟器纖維化有關(guān)，機(jī)制可能為PD-1作用后介導(dǎo)的抑制信號(hào)可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的過(guò)度激活，有效抑制T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌， 參與了眾多組織增生、肥大及纖維化[14，15]。本研究對(duì)肝臟PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.356，P<0.05）。

綜上所述，PD-1表達(dá)水平越高，慢性HBV攜帶者炎癥及纖維化進(jìn)展的可能性越大。因此，檢測(cè)PD-1的表達(dá)有助于評(píng)估肝臟組織炎癥及肝纖維化程度，肝臟PD-1表達(dá)可作為慢性HBV攜帶者病程進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝新生，劉敏. 慢性乙肝病毒攜帶者肝組織病理結(jié)果分析[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（8）：655-656.

[2] 馬薇，羅殿中，陳源，等. PD-L1和PD-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（9）：1551-1554.

[3] 王元元，謝長(zhǎng)好，孫美群，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)和意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（9）：962-965.

[4] 洪坤學(xué)，劉真，賈明明，等. HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平的研究[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12（8）：909-912.

[5] 韋麒，蘇明華，江建寧，等. PD-1表達(dá)與慢性乙型肝炎病毒感染病理的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)肝臟病雜志（電子版），2013，5（1）：6-11.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)，感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中華內(nèi)科雜志，2011，50（2）：168-179.

[7] 潘陳為，陳未來(lái)，諸葛璐，等. 慢性乙型肝炎病毒攜帶者血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平與肝超微結(jié)構(gòu)纖維化改變的相關(guān)性分析以及臨床意義[J]. 中國(guó)藥物與臨床，2012， 12（3）：310-311.

[8] 謝蕾. 慢性HBV攜帶者臨床與肝組織病理關(guān)系探討[J]. 現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2014，26（3）： 292-293.

[9] 史繼靜，劉朝奇. PD-1及其配體PD-L在HIV感染中的作用[J]. 生命的化學(xué)，2010，30（3）：397-400.

[10] Tao Shen，Jiajia Zheng，Chunhui Xu，et al. PD-1 expression on peripheral CD8+ TEM/TEMRA subsets closely correlated with HCV viral load in chronic hepatitis C patients[J]. Virology Journal，2010，7（12）：310-318.

[11] Chen J，Wang XM，Wu XJ，et al. Intrahepatic levels of PD-1/PD-L correlate with liver infl-ammation in chronic hepatitis B[J]. Infl amm Res，2011，60（1）：47-53.

[12] Zhang Wenjin，Peng Chuanhui，Wan Yunle，et al. Longitudinal fluctuations in PD1 and PD-L1 expression in association with changes in anti-viral immune response in chronic hepatitis B[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（8）：109-119.

[13] 趙紅，張平，賀兼斌. 硫化氫對(duì)肺纖維化大鼠 PD-1表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2014，34（4）：287-292.

[14] Feuth T，Arends JE，F(xiàn)ransen JH，et al. Complementary role of HCV and HIV in tactivation and exhaustion in T-cell HIV/HCV coinfection[J]. Plos One，2013，8（3）：1-9.

[15] Spahn J，Pierce RH，Crispe IN，et al. Ineffective CD8（+）T-Cell immunity to adeno virus can result in prolonged associated liver injury and fibrogenesis[J]. The American Journal of Pathology，2011，179（5）：2370-2381.

（收稿日期：2014-09-28）

2.4 PD-1與肝纖維化相關(guān)性分析

PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.356，P=0.011<0.05。PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為rs=0.780，P=0.000<0.05。

3 討論

乙肝病毒感染是我國(guó)最常見(jiàn)的肝臟感染性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，而其中慢性HBV攜帶者占了很大的比重[6]。慢性HBV攜帶者，經(jīng)各項(xiàng)檢查如肝功能以及CT、B超等影像學(xué)檢查往往無(wú)明顯異常的發(fā)現(xiàn)。但是，近年來(lái)愈來(lái)愈多的研究提示，乙肝進(jìn)展具有“隱蔽性”，許多ALT正常的慢性HBV感染患者，同樣存在肝損害，部分患者病變程度在G2、S2以上，甚至進(jìn)展到早期肝硬化階段[7，8]。本研究中也同樣存在這樣的情況，50例患者雖肝功能均正常范圍，影像學(xué)亦無(wú)明顯異常，但病理分級(jí)炎癥≥G2或纖維化≥S2的例數(shù)為15例。

PD-1是一種抑制性共刺激分子，在維持外周耐受中起著關(guān)鍵性的作用。既往的研究表明，PD-1與病毒感染后病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能衰竭及免疫耐受有關(guān)，其抑制病毒的清除，有助于病毒感染的慢性化[9]；Tao等[10]使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)37例慢性丙肝病毒感染患者與17例正常健康者的血標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙肝病毒慢性感染者CD8+淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)強(qiáng)度及百分比均較高于正常組。

研究也發(fā)現(xiàn)PD-1在乙肝病毒清除過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，與HBV慢性感染密切聯(lián)系[5，11]。免疫耐受是HBV感染慢性化的主要機(jī)制，PD-1通過(guò)切斷自身反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受，并抑制效應(yīng)性T細(xì)胞維持免疫耐受[12]。因此，HBV的持續(xù)感染與PD-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。隨著對(duì)PD-1研究的深入，更有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中PD-1表達(dá)與炎癥程度具有相關(guān)性。韋麒等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著炎癥活動(dòng)度的加重，PD-1的表達(dá)也更為顯著。但是目前對(duì)于慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)的臨床研究鮮有報(bào)道。

本研究納入50例慢性HBV攜帶者，肝穿刺活檢后病理染色，并進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)肝臟組織PD-1表達(dá)肝臟組織，并根據(jù)炎癥結(jié)果分為兩組：A組26例（炎癥G0）和B組24例（炎癥≥G1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B組患者肝臟組織PD-1表達(dá)水平明顯高于A組（P<0.05），也證明了在慢性HBV攜帶者，肝臟組織炎癥程度影響PD-1的表達(dá)。有學(xué)者認(rèn)為[13]，PD-1的表達(dá)增強(qiáng)使得免疫功能受到抑制，以避免持續(xù)活化的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝臟過(guò)度受損而引發(fā)功能進(jìn)一步惡化，但同時(shí)也使T細(xì)胞功能低下而不利于機(jī)體清除病毒，導(dǎo)致感染的慢性持續(xù)。因此，PD-1表達(dá)上調(diào)是機(jī)體在肝臟炎癥反應(yīng)加劇時(shí)的一個(gè)自我保護(hù)調(diào)節(jié)，也可以推斷在機(jī)體對(duì)乙肝病毒免疫應(yīng)答與免疫介導(dǎo)的肝臟損害中，PD-1表達(dá)可能起到平衡的作用。本研究對(duì)慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.780，P<0.05）。

近年研究表明，PD-1過(guò)度表達(dá)與多種臟器纖維化有關(guān)，機(jī)制可能為PD-1作用后介導(dǎo)的抑制信號(hào)可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的過(guò)度激活，有效抑制T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌， 參與了眾多組織增生、肥大及纖維化[14，15]。本研究對(duì)肝臟PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.356，P<0.05）。

綜上所述，PD-1表達(dá)水平越高，慢性HBV攜帶者炎癥及纖維化進(jìn)展的可能性越大。因此，檢測(cè)PD-1的表達(dá)有助于評(píng)估肝臟組織炎癥及肝纖維化程度，肝臟PD-1表達(dá)可作為慢性HBV攜帶者病程進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝新生，劉敏. 慢性乙肝病毒攜帶者肝組織病理結(jié)果分析[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（8）：655-656.

[2] 馬薇，羅殿中，陳源，等. PD-L1和PD-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（9）：1551-1554.

[3] 王元元，謝長(zhǎng)好，孫美群，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)和意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（9）：962-965.

[4] 洪坤學(xué)，劉真，賈明明，等. HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平的研究[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12（8）：909-912.

[5] 韋麒，蘇明華，江建寧，等. PD-1表達(dá)與慢性乙型肝炎病毒感染病理的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)肝臟病雜志（電子版），2013，5（1）：6-11.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)，感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中華內(nèi)科雜志，2011，50（2）：168-179.

[7] 潘陳為，陳未來(lái)，諸葛璐，等. 慢性乙型肝炎病毒攜帶者血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平與肝超微結(jié)構(gòu)纖維化改變的相關(guān)性分析以及臨床意義[J]. 中國(guó)藥物與臨床，2012， 12（3）：310-311.

[8] 謝蕾. 慢性HBV攜帶者臨床與肝組織病理關(guān)系探討[J]. 現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2014，26（3）： 292-293.

[9] 史繼靜，劉朝奇. PD-1及其配體PD-L在HIV感染中的作用[J]. 生命的化學(xué)，2010，30（3）：397-400.

[10] Tao Shen，Jiajia Zheng，Chunhui Xu，et al. PD-1 expression on peripheral CD8+ TEM/TEMRA subsets closely correlated with HCV viral load in chronic hepatitis C patients[J]. Virology Journal，2010，7（12）：310-318.

[11] Chen J，Wang XM，Wu XJ，et al. Intrahepatic levels of PD-1/PD-L correlate with liver infl-ammation in chronic hepatitis B[J]. Infl amm Res，2011，60（1）：47-53.

[12] Zhang Wenjin，Peng Chuanhui，Wan Yunle，et al. Longitudinal fluctuations in PD1 and PD-L1 expression in association with changes in anti-viral immune response in chronic hepatitis B[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（8）：109-119.

[13] 趙紅，張平，賀兼斌. 硫化氫對(duì)肺纖維化大鼠 PD-1表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2014，34（4）：287-292.

[14] Feuth T，Arends JE，F(xiàn)ransen JH，et al. Complementary role of HCV and HIV in tactivation and exhaustion in T-cell HIV/HCV coinfection[J]. Plos One，2013，8（3）：1-9.

[15] Spahn J，Pierce RH，Crispe IN，et al. Ineffective CD8（+）T-Cell immunity to adeno virus can result in prolonged associated liver injury and fibrogenesis[J]. The American Journal of Pathology，2011，179（5）：2370-2381.

（收稿日期：2014-09-28）

2.4 PD-1與肝纖維化相關(guān)性分析

PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.356，P=0.011<0.05。PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為rs=0.780，P=0.000<0.05。

3 討論

乙肝病毒感染是我國(guó)最常見(jiàn)的肝臟感染性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，而其中慢性HBV攜帶者占了很大的比重[6]。慢性HBV攜帶者，經(jīng)各項(xiàng)檢查如肝功能以及CT、B超等影像學(xué)檢查往往無(wú)明顯異常的發(fā)現(xiàn)。但是，近年來(lái)愈來(lái)愈多的研究提示，乙肝進(jìn)展具有“隱蔽性”，許多ALT正常的慢性HBV感染患者，同樣存在肝損害，部分患者病變程度在G2、S2以上，甚至進(jìn)展到早期肝硬化階段[7，8]。本研究中也同樣存在這樣的情況，50例患者雖肝功能均正常范圍，影像學(xué)亦無(wú)明顯異常，但病理分級(jí)炎癥≥G2或纖維化≥S2的例數(shù)為15例。

PD-1是一種抑制性共刺激分子，在維持外周耐受中起著關(guān)鍵性的作用。既往的研究表明，PD-1與病毒感染后病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能衰竭及免疫耐受有關(guān)，其抑制病毒的清除，有助于病毒感染的慢性化[9]；Tao等[10]使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)37例慢性丙肝病毒感染患者與17例正常健康者的血標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙肝病毒慢性感染者CD8+淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)強(qiáng)度及百分比均較高于正常組。

研究也發(fā)現(xiàn)PD-1在乙肝病毒清除過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，與HBV慢性感染密切聯(lián)系[5，11]。免疫耐受是HBV感染慢性化的主要機(jī)制，PD-1通過(guò)切斷自身反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受，并抑制效應(yīng)性T細(xì)胞維持免疫耐受[12]。因此，HBV的持續(xù)感染與PD-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。隨著對(duì)PD-1研究的深入，更有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中PD-1表達(dá)與炎癥程度具有相關(guān)性。韋麒等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著炎癥活動(dòng)度的加重，PD-1的表達(dá)也更為顯著。但是目前對(duì)于慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)的臨床研究鮮有報(bào)道。

本研究納入50例慢性HBV攜帶者，肝穿刺活檢后病理染色，并進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)肝臟組織PD-1表達(dá)肝臟組織，并根據(jù)炎癥結(jié)果分為兩組：A組26例（炎癥G0）和B組24例（炎癥≥G1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B組患者肝臟組織PD-1表達(dá)水平明顯高于A組（P<0.05），也證明了在慢性HBV攜帶者，肝臟組織炎癥程度影響PD-1的表達(dá)。有學(xué)者認(rèn)為[13]，PD-1的表達(dá)增強(qiáng)使得免疫功能受到抑制，以避免持續(xù)活化的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肝臟過(guò)度受損而引發(fā)功能進(jìn)一步惡化，但同時(shí)也使T細(xì)胞功能低下而不利于機(jī)體清除病毒，導(dǎo)致感染的慢性持續(xù)。因此，PD-1表達(dá)上調(diào)是機(jī)體在肝臟炎癥反應(yīng)加劇時(shí)的一個(gè)自我保護(hù)調(diào)節(jié)，也可以推斷在機(jī)體對(duì)乙肝病毒免疫應(yīng)答與免疫介導(dǎo)的肝臟損害中，PD-1表達(dá)可能起到平衡的作用。本研究對(duì)慢性HBV攜帶者患者肝組織PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝臟炎癥分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.780，P<0.05）。

近年研究表明，PD-1過(guò)度表達(dá)與多種臟器纖維化有關(guān)，機(jī)制可能為PD-1作用后介導(dǎo)的抑制信號(hào)可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的過(guò)度激活，有效抑制T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌， 參與了眾多組織增生、肥大及纖維化[14，15]。本研究對(duì)肝臟PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-1表達(dá)與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.356，P<0.05）。

綜上所述，PD-1表達(dá)水平越高，慢性HBV攜帶者炎癥及纖維化進(jìn)展的可能性越大。因此，檢測(cè)PD-1的表達(dá)有助于評(píng)估肝臟組織炎癥及肝纖維化程度，肝臟PD-1表達(dá)可作為慢性HBV攜帶者病程進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝新生，劉敏. 慢性乙肝病毒攜帶者肝組織病理結(jié)果分析[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（8）：655-656.

[2] 馬薇，羅殿中，陳源，等. PD-L1和PD-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（9）：1551-1554.

[3] 王元元，謝長(zhǎng)好，孫美群，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)和意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（9）：962-965.

[4] 洪坤學(xué)，劉真，賈明明，等. HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平的研究[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12（8）：909-912.

[5] 韋麒，蘇明華，江建寧，等. PD-1表達(dá)與慢性乙型肝炎病毒感染病理的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)肝臟病雜志（電子版），2013，5（1）：6-11.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)，感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中華內(nèi)科雜志，2011，50（2）：168-179.

[7] 潘陳為，陳未來(lái)，諸葛璐，等. 慢性乙型肝炎病毒攜帶者血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平與肝超微結(jié)構(gòu)纖維化改變的相關(guān)性分析以及臨床意義[J]. 中國(guó)藥物與臨床，2012， 12（3）：310-311.

[8] 謝蕾. 慢性HBV攜帶者臨床與肝組織病理關(guān)系探討[J]. 現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2014，26（3）： 292-293.

[9] 史繼靜，劉朝奇. PD-1及其配體PD-L在HIV感染中的作用[J]. 生命的化學(xué)，2010，30（3）：397-400.

[10] Tao Shen，Jiajia Zheng，Chunhui Xu，et al. PD-1 expression on peripheral CD8+ TEM/TEMRA subsets closely correlated with HCV viral load in chronic hepatitis C patients[J]. Virology Journal，2010，7（12）：310-318.

[11] Chen J，Wang XM，Wu XJ，et al. Intrahepatic levels of PD-1/PD-L correlate with liver infl-ammation in chronic hepatitis B[J]. Infl amm Res，2011，60（1）：47-53.

[12] Zhang Wenjin，Peng Chuanhui，Wan Yunle，et al. Longitudinal fluctuations in PD1 and PD-L1 expression in association with changes in anti-viral immune response in chronic hepatitis B[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（8）：109-119.

[13] 趙紅，張平，賀兼斌. 硫化氫對(duì)肺纖維化大鼠 PD-1表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2014，34（4）：287-292.

[14] Feuth T，Arends JE，F(xiàn)ransen JH，et al. Complementary role of HCV and HIV in tactivation and exhaustion in T-cell HIV/HCV coinfection[J]. Plos One，2013，8（3）：1-9.

[15] Spahn J，Pierce RH，Crispe IN，et al. Ineffective CD8（+）T-Cell immunity to adeno virus can result in prolonged associated liver injury and fibrogenesis[J]. The American Journal of Pathology，2011，179（5）：2370-2381.

（收稿日期：2014-09-28）