黃曉燕+楊曦+廉姜芳

[摘要] 目的 探討ERK1/2通路在IL-33激活心臟成纖維細胞中的表達及其作用。 方法 培養(yǎng)心臟成纖維細胞，10 ng/mL IL-33刺激細胞，不同時間點MTT法檢測IL-33對心臟成纖維細胞增殖的影響；RT-PCR檢測細胞標志性基因α-SMA 及通路關鍵分子TRAF-6的mRNA表達水平；Western blot檢測α-SMA 、TRAF-6及p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達。 結果 IL-33能促進心臟成纖維細胞的增殖（P<0.05）；IL-33刺激細胞24h，TRAF-6表達顯著上調(diào)（P<0.05），p-ERK1/2 蛋白水平表達明顯高于對照組（P<0.05）；IL-33干預24h后α-SMA表達明顯上調(diào)（P<0.05），ERK1/2特異性阻斷劑PD98059可有效抑制該效應。 結論 ERK1/2通路參與了IL-33誘導的心臟成纖維細胞增殖和纖維化過程。

[關鍵詞] IL-33/ST2信號通路；ERK1/2；心臟成纖維細胞

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）34-0004-04

心肌纖維化是心臟重構的重要組成部分，貫穿于心力衰竭發(fā)生發(fā)展的整個過程。已知心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFBs）過度增殖，膠原合成增多，排列紊亂是心肌纖維化的細胞病理學基礎[1]。CFBs在應激下可轉分化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MyoFBs）[2，3]，合成細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）能力增強。平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纖維細胞的標記性蛋白。

白細胞介素-33（interleukin，IL-33）是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，2005年被鑒定為白細胞介素-1（IL-1）類家族新成員。IL-33 與其受體ST2結合后，將活化信號傳導到胞內(nèi)，誘導Th2 細胞因子的產(chǎn)生，參與多種炎癥反應和免疫應答[4，5]。其中腫瘤壞死因子受體相關因子-6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）是IL-33介導下游信號傳導的關鍵信號分子。最近研究顯示，IL-33/ST2與纖維化疾病存在密切聯(lián)系，在肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化以及皮膚纖維化等纖維化疾病中發(fā)現(xiàn) IL-33和/或ST2表達水平發(fā)生了變化。IL-33/ST2在心肌纖維化過程中發(fā)揮的具體作用機制，還有待于進一步研究。本實驗旨在研究IL-33對心臟成纖維細胞增殖及纖維化過程中關鍵蛋白分子表達的影響以及下游通路活化的影響，探討IL-33與心肌纖維化的關系，為進一步明確心肌纖維化的發(fā)病機制及尋求新的治療靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心臟成纖維細胞由本實驗室保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司。重組IL-33購自美國Peprotech公司，MTT試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠α-SMA抗體、TRAF-6抗體購自SANT CRUZ公司。兔抗大鼠ERK1/2和p-ERK1/2購自CST公司，內(nèi)參GAPDH抗體購自Biolegend公司，堿磷酶標記山羊抗兔二抗、堿磷酶底物BCIP/NBT顯色濃縮液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ERK1/2特異性阻斷劑PD98059購自美國Sigma公司。蛋白Marker購自美國Fermentas公司。RIPA 蛋白裂解液購自碧云天公司，RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。根據(jù)GenBank序列設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 大鼠心臟成纖維細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 比色法檢測細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細胞，以0.5×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設5個復孔，并設調(diào)零孔，每孔體積200 μL。細胞經(jīng)IL-33分別誘導24、48及72 h，每孔加MTT 20 μL（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加DMSO 150 μL，置搖床上低速振搖10 min，使結晶充分溶解。酶聯(lián)免疫儀490 nm測吸光度值。上述實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR檢測標記性基因 α-SMA及信號通路關鍵因子TRAF-6的mRNA表達變化 取對數(shù)期生長細胞，消化后調(diào)整密度至5×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶。無血清培養(yǎng)基同步化饑餓12 h，再以10 ng/mL IL-33誘導24 h，其中檢測α-SMA時用40μM PD98059預處理60 min，RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄成cDNA。α-SMA上游引物：5'- ACTCTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3'，下游引物：5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGCT-3'；TRAF-6上游引物：5'- TCTCCCCTGCCTTCATTGTT-3'，下游引物：5'-AGGCTGGCGAT-TTTGTGTTT-3'；β-actin上游引5'-ACGGTCACAG-GTCATCACTATCG-3'，下游引物：5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。擴增條件：95℃預變性2 min；95℃變性15s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察掃描并進行電泳條帶分析，以目的條帶與β-actin條帶的比值作為目的條帶的相對值。各組實驗均重復3次。

1.2.4 Western blot檢測α-SMA、TRAF-6、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表達 細胞以10 ng/mL IL-33誘導24 h，其中檢測α-SMA時用40μM PD98059預處理60 min，收集細胞，預冷PBS洗滌2次，加入200 μL RIPA裂解液（每1 mL裂解液中加10 μL PMSF），冰上裂解30 min，超聲，4℃、12000 rpm離心10 min，取上清。Bradford法測定蛋白含量。4∶1體積比加入上樣緩沖液，100℃ 5 min變性。每孔上樣等量總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。30v轉膜150 min，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h。TBST洗膜3次，分別加入一抗α-SMA（1∶1000稀釋）、TRAF-6、ERK1/2和p-ERK1/2（1∶400稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入對應二抗（1∶500稀釋），室溫孵育1 h。最后BCIP/NBT顯色液暗處顯色觀察，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，磷酸化水平用磷酸化蛋白和總蛋白的相對值表示，目的蛋白水平用目的蛋白和內(nèi)參蛋白的相對值表示。各組實驗均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件進行，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-33對心臟成纖維細胞增殖的影響

加入10 ng/mL IL-33刺激細胞培養(yǎng)24、48、72 h 后，各組細胞生長狀態(tài)良好，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量不斷增多。MTT結果顯示，與未刺激組比較，IL-33明顯誘導細胞增殖（P<0.05），見表1。

2.2 IL-33對TRAF-6 mRNA和蛋白水平的影響

與對照組相比，TRAF-6 mRNA和蛋白水平均明顯上升（P<0.05），見圖1和表2。表明IL-33誘導心臟成纖維細胞時，活化其下游信號。

2.3 IL-33對p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達的影響

Western- blot 結果顯示，IL- 33刺激心臟成纖維細胞后ERK1/2總蛋白無明顯變化，而p-ERK1/2蛋白表達明顯升高，與對照組比較，有顯著性差異（P<0.05），見圖1和表2。表明IL-33/ST2-TRAF-6 信號通路激活后，引起下游ERK1/2通路的參與。

2.4 IL-33對α-SMA mRNA和蛋白水平的影響

α-SMA是肌成纖維細胞的標記性蛋白。我們結果顯示，IL- 33刺激成纖維細胞24 h后，α-SMA mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.05）；40 μM PD98059預處理60 min后，α-SMA水平較單純刺激組顯著減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1和表3。表明IL-33誘導了心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化，這一過程可以被ERK1/2特異性阻斷劑所抑制。

3 討論

心力衰竭是各種危重心血管疾病的終末階段，由于心肌損傷，引起心肌間質(zhì)纖維化、心肌肥大和心功能不良，限制心肌細胞活動，降低心室順應性，影響心肌的收縮和舒張功能，導致心臟重構[6，7]。在慢性炎癥過程中，有多種炎癥細胞參與，并釋放多種炎癥因子，導致肌成纖維細胞的形成并大量分泌ECM，最終導致纖維化[2，8-9]。因此確切認識心肌纖維化發(fā)生機制，有針對性地采取措施，進而有效預防和逆轉心肌纖維化，對心衰的早期治療也有著重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)IL-33廣泛存在于多種組織和細胞上，如成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞，在哮喘、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎癥、抗動脈粥樣硬化、抗心肌細胞肥大和心肌纖維化的過程中發(fā)揮重要作用[10]。IL-33可特異性激活ST2，ST2基因編碼產(chǎn)生兩種蛋白：跨膜形式ST2L和分泌形式sST2。在生物機械壓力的誘導下， 心肌細胞和心臟成纖維細胞均能表達ST2。在IL-33/ST2信號通路中，IL-33與ST2L、IL-1受體輔助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）組成受體復合物，活化下游信號TRAF6、轉化生長因子相關-1（TAK1），進而激活p38、JNK、NF-kB 等通路發(fā)揮生物學作用。sST2可負向調(diào)節(jié)IL-33/ST2通路的傳導[4]。有研究證實，TRAF6 是IL-33介導p38、JNK 和NF-kB活化的關鍵信號分子[5，11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33能誘導心臟成纖維細胞明顯表達TRAF-6，表明有IL-33/ST2通路的激活。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在許多心血管疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，如心肌肥厚、心肌纖維化及心力衰竭等[13，14]。MAPK包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/應急激活的蛋白激酶（SAPK）及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）三條通路，其中ERK1/2是心肌梗死后心室重塑的重要信號通路之一[15，16]。有研究報道，醛固酮通過激活ERK1/2 而刺激心臟成纖維細胞增殖，而且抑制ERK1/2活化能抑制IL-1β 誘發(fā)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌[15-17]。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，在心臟成纖維細胞中IL-33 /ST2 通路活化后能進一步激活下游ERK1/2通路。已知α-SMA是肌成纖維細胞的標記性蛋白，成纖維細胞增殖、活化后其表達升高。本研究通過IL- 33誘導建立纖維化細胞模型，在這一過程中α-SMA 基因和蛋白水平明顯表達，并且這一效應能被ERK1 /2特異性阻斷劑PD98059所阻斷。因此，IL- 33能誘導心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化，這一過程有IL-33/ST2-TRAF-6- ERK1/2通路參與調(diào)控。當然目前對IL-33在心肌纖維化中的作用機制還有待于進一步闡明，期望能為心肌纖維化治療研究提供新思路。

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（收稿日期：2014-09-11）