翁春媚，齊 明，王海蓉，華朝暉，包小梅

（1. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌 323300；2. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400）

杉木中等位酶與早期生長性狀間的相關(guān)研究

翁春媚1，齊 明2*，王海蓉1，華朝暉1，包小梅1

（1. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌 323300；2. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400）

從杉木種子園中采集 11個優(yōu)良品種自由授粉家系的分系種子開展杉木等位酶與早期生長性狀間的相關(guān)研究，PAGE等位酶實驗共篩選出 9個等位酶用于遺傳分析。結(jié)果表明，苗高、地徑在家系間存在顯著差異，研究群體存在豐富的遺傳變異；有5個等位酶位點（基因型）與苗高生長顯著相關(guān)，其中X8（MNR-1）和X14（SKDH-1）為正效應，其它X2（GOT-2）、X9（MNR-2）和X15（SKDH-2）均為負效應，不同位點對苗高性狀表達的作用不等效；有5個等位酶位點與地徑的生長顯著相關(guān)，其中除了X15為正效應外（純合體有利于地徑的生長），其它X7（MDH-4）、X12（6PGD-2）、X14（SKDH-1）和X17（Me-2）均為負效應，不同位點對地徑性狀表達的作用也不等效；比較地徑和苗高，還發(fā)現(xiàn)SKDH-1和SKDH-2同時對地徑苗高有作用，但作用方向相反：SKDH-2純合體BB有利于地徑生長，SKDH-2雜合體AB有利于苗高的生長；SKDH-1純合體BB有利于苗高生長，SKDH-1雜合體AB有利于地徑的生長。

杉木；等位酶；PAGE；早期鑒定

林木的早期性狀一直倍受育種工作者的重視，因為將它們用于早期鑒定、早期選擇時，會縮短林木的育種周期。Li和Mckeand[1]指出，即使在早晚相關(guān)較弱的情況下，早期選擇也會節(jié)約時間和財力。早期選擇的假設(shè)是假定一組的基因在早期控制某一經(jīng)濟性狀的表達，并且在林木生長發(fā)育（成熟）過程中繼續(xù)表達，這構(gòu)成了林木早晚相關(guān)的基礎(chǔ)。由于林木在不同的生長階段，林木的生長、發(fā)育和成熟是由多種類型的多基因控制的，當然也會有部分基因一直表達[2]。盡管林木發(fā)育階段多基因調(diào)控的復雜性，但是早期生長性狀是后來生長、發(fā)育的基礎(chǔ)和表現(xiàn)良好的指示劑[3]。成本和收益分析[4]揭示出，即使早晚相關(guān)低到 0.6，調(diào)整早期選擇的方法進行早期選擇比推遲選擇劃算。因為這個原因，評價早期生長性狀仍然是值得做的工作。因為基因型選擇比表型選擇更可靠，早期選擇的遺傳基礎(chǔ)是等位酶與早期性狀間的相關(guān)。只要這種相關(guān)在統(tǒng)計上是顯著的，便可用于選擇優(yōu)良的基因型。

近年來，隨分子生物學的發(fā)展，利用分子標記研究生物變異也越來越廣泛。但相比而言，用同工酶研究林木遺傳變異具有操作簡單、成本低、共顯性表達、能間接反映DNA水平的變異等優(yōu)點。等位酶技術(shù)已經(jīng)廣泛地應用在眾多的用材樹種的遺傳育種工作中，十分成熟。

通過利用中性標記與影響數(shù)量性狀的基因位點之間的連鎖或相關(guān)關(guān)系，進行標記輔助選擇（MAS）的方法，來改良現(xiàn)有的商業(yè)用材林。MAS能夠在早期淘汰那些不具有生長潛力的親本或個體，從而大大地降低了子代測定的規(guī)模與時間。本研究采用Bush[5]和Smouse[6]的適應距離法來研究生長性狀與等位酶間的相關(guān)，目的是為標記輔助選擇、育種材料的早期鑒定以及雜交育種親本選配提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 育苗試驗

2010年從浙江省遂昌縣杉木（Cunninghamia lanceolata）種子園中采集11個自由授粉家系的分系種子，它們是龍15、閩33、陽11、1391、1419、高37、1366、靖70、麗55、1278、1339，江西紅心杉混種作對照，共12份品種。于2011年3月，在富陽萬市展開容器育苗，塑料杯高13 cm、直徑14 cm，培養(yǎng)基質(zhì)為稻田土與河沙按3：1的比例進行混均，再加3 g/kg復合肥，每個培養(yǎng)杯播5粒種子，完全隨機區(qū)組設(shè)計，三個區(qū)組10株行狀小區(qū)，5月份間苗至每杯1株。整個試驗到12月結(jié)束，進行苗高、地徑調(diào)查，采用Matlab7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2 等位酶分析

抽取 11個優(yōu)良家系進行等位酶分析（紅心杉對照不包括在PAGE實驗中）。PAGE等位酶實驗是用每個品種10粒種子的胚乳。電泳緩沖體系，染色方法、酶的命名都是沿用國際著名學者（如：Yeh FC）淀粉膠電泳的體系，酶的遺傳控制與連鎖的研究結(jié)果亦與他們一致[7～12]。

經(jīng)過預備試驗，從21個等位酶系統(tǒng)中，篩選出9個等位酶，用于遺傳分析，參與分析的這9個等位酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGD E.C.1.1.1.44)、蘋果酸脫氫酶（MDH,EC.1.1.1.37）、蘋果酸酶（ME, E.C.1.1.1.40）、α-淀粉酶（α-Amylase, E.C.3.2.1.1）、甲酸脫氫酶（FDH, E.C.1.2.1.2）、莽草酸脫氫酶（SKDH, E.C.1.1.1.26）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（Got, E.C.2.6.1.1）、維生素K3降解酶（Mnr, E.C.1.6.99.2）、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI E.C.5.3.1.9），共9個酶系統(tǒng)21位點，18個多態(tài)位點，每個位點2個基因。所有這些酶系統(tǒng)顯示出孟德爾方式遺傳和共顯性表達，并且到現(xiàn)在為止，在杉木中尚未發(fā)現(xiàn)這些酶位點形成緊密連鎖群。

1.3 回歸分析

在回歸分析前，我們假定[13～17]：①11個自由授粉的家系采自多系種子園，種子園花粉隨機授粉，同一家系的種子間是半同胞關(guān)系（因此家系平均值即為一般配合力）；②等位酶標記在等位基因間是共顯性；③在不同的位點間等位酶標記間不存在上位效應；④等位酶不同位點間簡單而穩(wěn)定的遺傳，不存在連鎖；⑤遺傳符合孟德爾遺傳規(guī)律；⑥數(shù)量性狀是由多基因控制的；⑦與某個數(shù)量性狀相關(guān)的等位酶基因位于相同或不同的染色體上。

基于以上假設(shè)，采用如下模型（表 1）進行相關(guān)性研究。一個位點兩個基因A和B，對應基因頻率分別是p和q，群體近交比率s = 0.1[18]。

以親本苗高和地徑平均值為變量，等位酶位點上的基因型值為自變量，采用DPS軟件進行回歸分析，以研究等位酶與數(shù)量性狀間的相關(guān)，分析結(jié)果如下。

表1 使用遺傳變量來預測基因型的適合度[9]Table 1 Fitness for predicting genotypes by genetic variables

以親本苗高和地徑平均值為變量，等位酶位點上的基因型值為自變量，采用DPS軟件進行回歸分析，以研究等位酶與數(shù)量性狀間的相關(guān)，分析結(jié)果如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗高地徑的差異性分析

育苗基質(zhì)等環(huán)境條件一致，可采用單因素組內(nèi)觀察數(shù)不等的模型，進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見表2。

表2 12個杉木品種一年生時苗高、地徑方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA on 1-year seedling height and ground diameter of 12 C. lanceolata families

由表2可見，苗高、地徑在家系間存在顯著差異，研究群體存在豐富的遺傳變異。苗高、地徑在家系水平上的遺傳力分別為0.607 5和0.792 9。

2.2 等位酶對苗高的回歸分析結(jié)果

苗高經(jīng)方差分析，獲得親本的一般配合力，以此為因變量 Z，以不同位點的基因型為自變量，多元回歸結(jié)果如下：

式中，X2為GOT-2上的基因型，X8為MNR-1上的基因型，X9為MNR-2上的基因型，X14為SKDH-1上的基因型，X15為SKDH-2上的基因型，Z是親本的苗高的一般配合力。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可見，(1)式的F值= 2 332.738 6***，所求回歸函數(shù)極其顯著。

（1）式的決定系數(shù)R2= 0.999 9，復相關(guān)系數(shù)R = 0.999 99***的顯著性，達到1‰的統(tǒng)計水平。

綜合以上結(jié)果，可以得出如下結(jié)論，（1）式所求回歸函數(shù)十分有效。入選變量的分析結(jié)果列于表4。

表4 入選變量的回歸信息Table 4 Regression of selected variables

由表4可見，逐步回歸函數(shù)中的自變量（等位酶基因型）與苗高間有顯著的相關(guān)；不同酶位點對苗高生長的表達不等效，其影響力的順序為：X9> X2> X8> X14> X15。

2.3 等位酶對地徑的回歸分析結(jié)果

以地徑Y(jié)為因變量，以不同位點的基因型為自變量，逐步回歸函數(shù)如下：Y = 3.910 97-0.396 229X7-0.040 962 X12-0.228 84X14＋0.039 946 X15-0.02 633 7X17（2）

式中，X7為MDH-4上的基因型，X12為6PGD-2上的基因型，X14為SKDH-1上的基因型，X15為SKDH-2上的基因型，X17為Me-2上的基因型，Z是親本的地徑的一般配合力。

由表5可見，（2）式的F值 = 53 046.068***，所求回歸函數(shù)極其顯著，（2）式的決定系數(shù)R2=0.999 9，復相關(guān)系數(shù)R = 0.999 99***的顯著性，達到1‰的統(tǒng)計水平。

綜合以上結(jié)果，可以得出如下結(jié)論，（2）式所求回歸函數(shù)十分有效。入選變量的分析結(jié)果列于表6。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of ANOVA

表6 入選變量的回歸信息Table 6 Regression of selected variables

由表6 可見，（1）逐步回歸函數(shù)中的自變量（等位酶基因型）與地徑間有顯著的相關(guān)；（2）不同酶位點對地徑生長的表達不等效，其影響力的順序為：X7> X14> X15> X17> X12，這一研究結(jié)果與苗高一致。

3 結(jié)論與建議

通過逐步回歸分析揭示出，有5個等位酶位點（基因型）與杉木的苗高生長顯著相關(guān)，其中X8（MNR-1）和X14（SKDH-1）為正效應（純合體有利于苗高的生長），其它X2（GOT-2）、X9（MNR-2）和X15（SKDH-2）均為負效應，即在這些位點上，雜合體有利于苗高的生長。同時發(fā)現(xiàn)不同位點對苗高性狀表達的作用不等效。

通過等位酶分析和逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)亦有5個等位酶位點（基因型）與地徑的生長顯著相關(guān)，其中除了X15（SKDH-2）為正效應外（純合體有利于地徑的生長），其它X7（MDH-4）、X12（6PGD-2）、X14（SKDH-1）和X17（Me-2）均為負效應，即在這些位點上，雜合體有利于地徑的生長。與苗高一樣，不同位點對地徑性狀表達的作用不等效。

比較地徑和苗高的分析結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)SKDH-1和SKDH-2同時對地徑苗高有作用，但作用方向相反：SKDH-2純合體BB有利于地徑生長，SKDH-2雜合體AB有利于苗高的生長；SKDH-1純合體BB有利于苗高生長，SKDH-1雜合體AB有利于地徑的生長。有相同的等位酶作用于苗高、地徑的生長，很可能是苗高地徑間存在相關(guān)的一個原因。

已有的研究表明：同工酶具有組織多型性和組織特異性。Second 和tronslot以及Second發(fā)表了他們在水稻中研究的結(jié)果：多數(shù)的等位酶會在多個器官中表達，只是酶的活力和酶譜式樣存在變化。針對這一現(xiàn)象，在杉木遺傳改良中如何運用本研究的成果呢？首先要選擇相同研究材料，如發(fā)芽種子胚乳；其次要采用相同的實驗條件，尤其是相同的電泳緩沖體系（注：電極緩沖體系決定了等位酶酶譜式樣），那么等位酶實驗結(jié)果是一致的、可重復的。本研究揭示：有6個等位酶的信息，就可以對杉木種子園中的待測親本進行初步評選。但本研究有幾個問題：在該模型中其一就是BB純合體總比AA優(yōu)越，這是模型造成的，所有的學者都這么用這個適合度模型；其二，由于本試驗參試家系較少，苗木數(shù)較少，未能進行多點造林試驗，生長量僅一年生苗高、地徑，所以本研究僅是一種探索，研究結(jié)果作為未來研究的一種參考；其三，今后要進行擴大試驗，采用多地點多年度的資料來詳細研究等位酶與經(jīng)濟性狀的相關(guān)。

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Correlation between Allozyme and Early Growth Traits in Cunninghamia lanceolata

WENG Chun-mei1，QI Ming2*，WANG Hai-rong1，HUA Chao-hui1，BAO Xiao-mei
（1. Suichang Forestry Extension Station of Zhejiang, Suichang 323300, China; 2. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, 311400, China）

11 plus families were selected in 2010 from Cunninghamia lanceolata seed orchard in Suichang, Zhejiang province, for container seedling cultivation with one control in March, 2011 in Fuyang of the same province. Determinations of height and ground diameter were implemented in December of the same year. 9 allozymes were selected by polyacrylamid gel electrophoresis method using 10 embryosperms of 11 tested families. Adaptive distance model by Smouse(1986)and Bush (1987) was used, regression models between growth traits and allozyme genotypes had been established. The results showed that seedling height and ground diameter had great differences among families, five allozyme loci had evident correlation with seedling height growth and 5 ones hade significant correlation with ground diameter. The experiment proved that different allozyme loci had different marginal effects on fitness. The result demonstrated that allozyme analysis could be used for the early selection of parents in seed orchard of C. lanceolata.

Cunninghamia lanceolata; allozyme; PAGE; early selection

S718.46

：A

1001-3776（2015）06-0045-05

2015-07-05；

2015-10-25

浙江省”十二五”竹木育種專題“杉木高生產(chǎn)力優(yōu)質(zhì)新品種選育及示范”（2012C12908-11）

翁春媚（1965-），女，浙江遂昌人，從事林木遺傳育種研究；*通訊作者。