魏冬旭，江連洲*，王 辰，王中江

pH值對大豆11S球蛋白結構和表面疏水性的影響

魏冬旭1,2，江連洲1,*，王 辰3，王中江1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；3.大理學院工程學院，云南 大理 671003）

采用Lowry法、8-苯氨基萘-1-磺酸銨鹽（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid ammonium salt，ANS）熒光探針法研究pH值對大豆11S球蛋白的溶解性和表面疏水性的影響，并利用圓二色光譜和熒光光譜對不同pH值條件下11S球蛋白二級結構和三級結構進行分析，為研究大豆蛋白結構與表面疏水性之間的構效關系提供理論基礎。結果表明：除等電點外，大豆11S球蛋白溶解性和表面疏水性呈負相關，并且隨著pH值的升高，大豆球蛋白二級結構中發(fā)生β-折疊和無規(guī)卷曲向α-螺旋的轉變，三級結構中色氨酸（Trp）殘基微環(huán)境極性降低。大豆球蛋白的表面疏水性與α-螺旋結構含量呈負相關。

大豆11S球蛋白；pH值；結構；表面疏水性

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，對蛋白質的需求量日益增加。大豆蛋白由于其具有較高的營養(yǎng)價值、良好的功能特性等優(yōu)點，已作為一種功能性成分被廣泛應用于不同食品和化工領域中[1-4]。其中，溶解性由于可限制蛋白質其他功能特性的發(fā)揮而成為大豆蛋白非常重要的一個功能特性[5-9]。蛋白質的溶解性取決于蛋白質分子間親水性/疏水性的平衡，由于蛋白質是空間結構復雜的大分子，表面疏水性影響分子間的相互作用，比整體疏水性對蛋白質功能具有更大的影響[10]。研究表明蛋白質表面疏水性也顯著影響著蛋白質的其他功能特性[11-12]，由此可知，蛋白質的表面疏水性是衡量蛋白質功能特性的關鍵指標之一。

大豆蛋白的表面疏水性和大豆蛋白的結構特征密切相關[13-14]。蛋白質的分子結構和功能性質與它所處環(huán)境的pH值緊密相關[15]。圓二色光譜和熒光光譜是測定溶液中蛋白分子結構的兩種常用方法。在研究蛋白質的圓二色光譜特征時，由于蛋白質分子質量大小不一，一般使用平均氨基酸殘基分子質量為標準。由于氨基酸殘基沒有圓二色光譜特性，因此蛋白質的圓二色光譜特性僅和結構有關。圓二色光譜分為遠紫外區(qū)和近紫外區(qū)，利用遠紫外圓二色光譜可以推算蛋白質分子中α-螺旋等二級結構的含量。熒光光譜法主要是研究蛋白質三級結構的差異，分析蛋白空間微環(huán)境的變化。

本實驗通過圓二色光譜、熒光光譜等方法系統(tǒng)研究pH值對大豆11S球蛋白的空間結構和表面疏水性的影響，探討pH值改變條件下大豆11S球蛋白空間結構與表面疏水性之間的構效關系，為進一步改善大豆蛋白的功能性質、提高大豆蛋白實際應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

大豆（東農(nóng)46號）購于東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所。大豆經(jīng)破皮、粉粹后過60目篩，再經(jīng)石油醚脫脂后獲得脫脂大豆粉。

Lowry法蛋白質含量測定試劑盒上海荔達生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid ammonium salt，ANS）美國Sigma公司；其他試劑最低純度為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

J-815圓二色光譜日本Jasco公司；F-4500型熒光分光光度計日本Hitachi公司；PHSJ-4A型實驗室pH計上海雷磁公司；低溫高速離心機美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1大豆11S球蛋白的制備

參考Nagano等[16]的方法，按照1∶15（m/V）料液比將脫脂大豆粉與去離子水混合，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至7.5，低速攪拌1 h后20℃、10 000×g離心15 min。所得上清液中按0.98 g/L比例加入亞硫酸鈉，攪拌1 h后用2 mol/L鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值至5.5，然后在4℃條件下放置過夜，12 000×g離心20 min，所得沉淀即為大豆11S球蛋白。獲得的大豆11S球蛋白組分進一步用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析組成。通過光密度掃描分析，大豆11S球蛋白純度約為92%。

1.3.2緩沖液的配制

配制0.01 mol/L的pH 2～6的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液、pH 7～9的Tris-鹽酸緩沖液、pH 10的甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH 11和pH 12的氫氧化鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。

1.3.3溶解度的測定

準確稱取100 mg 11S球蛋白樣品溶于10 mL不同pH值的緩沖液中，磁力攪拌30 min后20℃、12 000×g離心20 min。上清液經(jīng)適量稀釋，采用Lowry法測定蛋白質含量[17]，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比。

1.3.4表面疏水性的測定

參考Kato等[18]的ANS熒光探針法。準確稱取一定量的11S球蛋白樣品溶于0.01 mol/L不同pH值緩沖液中，配制成10 mg/mL的溶液，室溫條件下磁力攪拌1 h后4℃條件下10 000×g離心20 min，用Lowry法測定上清液蛋白濃度，并用不同pH值緩沖液依次稀釋（濃度在0.005～0.5 mol/mL之間）后，取不同濃度的樣品溶液4 mL加入50μL8 mmol/L的ANS溶液，充分振蕩混勻后靜置10 min，測定樣品的熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。實驗中激發(fā)波長λex=330 nm，發(fā)射波長λem=490 nm，夾縫5 nm。以熒光強度對蛋白質含量作圖，外推至蛋白質含量為0，曲線初始階段的斜率代表蛋白質分子的表面疏水性指數(shù)（H0）[19]。

1.3.5圓二色光譜分析

準確稱取一定量的11S球蛋白樣品溶于不同pH值緩沖液中，質量濃度為0.4 mg/mL，室溫下放置4 h。采用pH計對樣液監(jiān)控。采用J-815圓二色光譜儀掃描190～250 nm波長范圍內的遠紫外圓二色光譜，樣品池光程為1 mm，靈敏度為100 mdeg/cm，掃描速率為100 nm/min，分辨率0.1 nm，實驗溫度為20℃。圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減，掃描5次結果的平均值為最后得到的圓二色光譜。蛋白二級結構組成采用CDPro曲線擬合軟件包，最后以平均殘基摩爾橢圓度[θ]（deg·cm2/dmol）表示。

1.3.6熒光光譜分析

準確稱取大豆11S球蛋白分散于不同pH值緩沖液中，球蛋白質量濃度為0.3 mg/mL。采用F-4500型熒光分光光度計測定11S球蛋白的內源性熒光光譜。熒光光譜分析以蛋白質分子內部色氨酸熒光基團為探針，為了降低酪氨酸熒光特性的貢獻，熒光光譜激發(fā)波長設為295 nm，發(fā)射光譜波長掃描范圍為300～400 nm，狹縫為5 nm，每個樣品溶液掃描5次。

1.4統(tǒng)計分析

每個實驗重復3次，以±s表示最終實驗結果。采用SPSS軟件對數(shù)值進行ANOVA差異顯著性分析。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白溶解度的影響

圖1 不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白溶解度的影響Fig.1 Influence of pH on the solubility of glycinin

大豆11S球蛋白的理論等電點是6.4[16]，但是大豆品種不同，提取出的球蛋白會存在差異，導致等電點有所不同。本實驗選取的大豆11S球蛋白的等電點在pH 5～6，由圖1可知，11S球蛋白的溶解度在pH 5左右出現(xiàn)最小值，因為等電點附近11S球蛋白的表面帶電量接近于0 mV，蛋白質分子失去靜電排斥力后會發(fā)生聚集，形成沉淀，因此溶解度最小。遠離等電點時分子間靜電斥力增加，球蛋白空間結構展開，使得蛋白質分子分散在溶液中[20]，因此在pH 5兩側11S球蛋白溶解性均顯著升高（P＜0.05）。這可能是在強酸或強堿條件下，大豆11S球蛋白空間結構在很大程度上展開，同時伴隨其亞基之間二硫鍵的斷裂。

由于食品加工過程中不涉及極端酸堿的處理，因此選取pH 4～10范圍進行研究。如圖1所示，大豆11S球蛋白在pH 5～6時，溶解度低于10%，溶解性較差，并有沉淀和聚集體的形成。較低溶解性時無法進行光譜分析，因此在光譜分析中未選取此段pH值。本實驗中圓二色光譜和熒光光譜針對pH 7～10范圍進行譜圖分析。

2.2不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白表面疏水性的影響

圖2 不同pH值緩沖液處理對11S球 蛋白表面疏水性的影響Fig. 2 Influence of pH on surface hydrophobicity of glycinin

由圖2可知，11S球蛋白的表面疏水性在pH 5附近出現(xiàn)最小值，與11S球蛋白溶解度曲線比較發(fā)現(xiàn)，除等電點外，在其他pH值條件下11S球蛋白的表面疏水性和溶解度呈負相關。這主要是由于蛋白質的溶解性取決于分子親水性和疏水性之間的平衡，這種平衡取決于蛋白分子的氨基酸組成，尤其取決于分子表面的氨基酸組成[21]。在氨基酸側鏈殘基中，疏水性殘基通過疏水鍵相互作用在蛋白質分子中心形成疏水性區(qū)域；親水性氨基酸殘基分布在蛋白質分子外側形成親水性區(qū)域[22]。在天然蛋白質中，許多非極性基團（疏水基團）被包埋在分子內部，導致蛋白質疏水性較低；但發(fā)生pH值偏移處理后，原先包裹在11S球蛋白內部的疏水側鏈會暴露在分子表面的極性環(huán)境中，蛋白質的疏水性就會發(fā)生改變。但由于蛋白質并非上述一種結構模式，疏水性氨基酸殘基如果暴露在分子表面，則表現(xiàn)為一定的疏水性，親水溶解性降低，而具有較高溶解性的蛋白質分子表面也存在少量的疏水性殘基。由于疏水、親水程度不同，造成蛋白質不同的溶解分散性[23]。

2.3不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白二級結構的影響

圖3 不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白圓二色光譜Fig.3 Circular dichroism spectra of glycinin at different pH levels

采用遠紫外區(qū)圓二色光譜研究不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白二級結構的影響。如圖3所示，蛋白質的圓二色光譜分為遠紫外區(qū)域和近紫外區(qū)域，遠紫外區(qū)域是肽鍵的吸收峰范圍，反映了肽鏈構象。在遠紫外區(qū)域，天然大豆蛋白質在194 nm波長附近顯示一個正峰，218 nm波長處顯示一個負峰，表明存在β-折疊結構；208 nm和222 nm波長處顯示兩個負凹槽，表示存在α-螺旋結構；204 nm和224 nm波長附近產(chǎn)生雙正峰代表存在β-轉角結構；在220～230 nm波長之間存在一個微弱的正峰，是無規(guī)卷曲結構的特征峰。由以上結果可知，11S球蛋白包含4類二級結構：α-螺旋，β-轉角，β-折疊和無規(guī)卷曲，其中α-螺旋含量較低，β-折疊及無規(guī)卷曲含量較高[24]。

表1為根據(jù)圖3經(jīng)計算機擬合得到的11S球蛋白二級結構變化情況。11S球蛋白中α-螺旋結構的含量隨pH值的升高而增大，β-折疊結構和無規(guī)卷曲結構含量隨pH值的升高而降低，β-轉角結構含量無明顯變化，這表明隨著pH值的升高，11S球蛋白發(fā)生由β-折疊和無規(guī)卷曲結構向α-螺旋結構的轉變。

表1 不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白二級結構含量Table 1 Secondary structure contents of glycinin at different pH levels%

不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白在208 nm及222 nm波長處的平均殘基摩爾橢圓度[θ]見圖4。由于208、222 nm是α-螺旋結構的特征峰，可以用于直觀分析α-螺旋的變化趨勢。由圖4可知，11S球蛋白α-螺旋結構的含量會隨208 nm和222 nm兩處負凹槽強度增加而增大，通過[θ]208nm及[θ]222nm兩處絕對值增加可以看出，隨著pH值的升高，11S球蛋白二級結構中α-螺旋的含量逐漸增大，與表1中程序分析結論一致。

圖4 不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白平均殘基摩爾橢圓度Fig.4 Mean residue ellipticity of glycinin at different pH levels

Hou等[25]報道，蛋白表面疏水性和α-螺旋含量呈負相關。分析原因可能是蛋白質分子內α-螺旋結構含量增加時，蛋白質分子發(fā)生了輕微的聚集，部分非極性基團和疏水基團被包裹在分子內部，導致表面疏水性下降。因此，在pH 7～10的范圍內，11S球蛋白[θ]222nm的絕對值隨pH值的升高增大（圖4），表明分子內α-螺旋結構含量逐漸升高，這與11S球蛋白表面疏水性呈負相關。

2.4不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白三級結構的影響

側鏈的變化可以反映大豆蛋白三級結構的改變。pH值改變后，處于大豆11S球蛋白內部的疏水側鏈會暴露在分子外部的極性環(huán)境中，或處于蛋白外部的疏水性側鏈內卷于分子內部非極性環(huán)境中，這種微環(huán)境的變化導致色氨酸內源熒光光譜的改變。在295 nm波長處激發(fā)產(chǎn)生的光譜主要是由色氨酸殘基發(fā)射[20]，11S球蛋白的熒光峰實際上是色氨酸殘基的熒光峰，峰位一般在325～350 nm波長范圍波動[26]。

蛋白質是由氨基酸通過肽鍵按一定順序連接起來的、具有一定空間結構的大分子，由于分子內含有大量可解離的基團，蛋白質在不同環(huán)境中會呈現(xiàn)不同的狀態(tài)。蛋白質分子可解離的基團除氨基和羧基外，還有大量凸出的側鏈基團，如組氨酸的咪唑基、酪氨酸的羥基等[27]。外部環(huán)境酸堿度的改變能夠引起蛋白質可解離基團的電離情況變化，從而導致蛋白質結構發(fā)生改變。因此通過研究溶液中pH值的變化對11S球蛋白熒光性質的影響，可以得出蛋白三級結構變化的信息。由圖5可知，在pH 7～10的范圍內，不同pH值緩沖液處理對11S球蛋白的熒光光譜峰形幾乎沒有影響，但熒光強度和λmax發(fā)生了改變，其變化情況見表2。

圖5 不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of glycinin at different pH levels

表2 不同pH值緩沖液處理后11S球蛋白的熒光強度及Table 2 Fluorescence intensity andλmmaaxxof glycinin at different pH levels

表2為經(jīng)過不同pH值緩沖液處理后樣品的熒光強度和λmax，二者的改變反映了色氨酸殘基變化的程度和所處微環(huán)境的變化。在pH 7～10的范圍內，隨著pH值的增大，11S球蛋白的熒光強度逐漸降低。分析熒光強度的變化原因，可能由于蛋白分子受到酸堿度的影響，分子內色氨酸殘基發(fā)生熒光淬滅作用[27]，導致色氨酸殘基熒光強度降低。

λmax與色氨酸殘基所處的微環(huán)境有關，λmax小于330 nm表明色氨酸殘基位于分子內部非極性環(huán)境中，λmax大于330 nm表明色氨酸殘基位于外部極性環(huán)境中[28]。由表2可知，不同pH值條件下11S球蛋白的λmax均大于330 nm，說明有色氨酸殘基分布在蛋白質分子外部極性環(huán)境中。但隨著pH值的升高，11S球蛋白的λmax向短波方向移動（發(fā)生藍移），表明蛋白發(fā)生了聚集，部分色氨酸殘基包埋于分子內部的非極性環(huán)境中，其所處的微環(huán)境極性降低。

3 結 論

采用圓二色光譜和熒光光譜研究pH值對11S球蛋白結構和表面疏水性的影響，得到如下結論：除等電點外，11S球蛋白的表面疏水性與溶解性呈負相關（r=-0.716，P＜0.05）；圓二色光譜結果分析表明，在pH 7～10范圍內，隨著pH值的升高，11S球蛋白二級結構中α-螺旋含量逐漸增加，β-折疊和無規(guī)卷曲含量逐漸降低，表明11S球蛋白的表面疏水性與α-螺旋呈負相關；熒光光譜分析結構表明，在pH 7～10范圍內，隨著pH值的升高，11S球蛋白的熒光強度和λmax均逐漸降低，表明11S球蛋白中色氨酸殘基逐漸“包埋”于分子內部，其所處的微環(huán)境極性降低，與11S球蛋白溶解性增加、表面疏水性降低結論相符。

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Influence of pH on Structure and Surface Hydrophobicity of Glycinin

WEI Dongxu1,2, JIANG Lianzhou1,*, WANG Chen3, WANG Zhongjiang1
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 3. College of Engineering, Dali University, Dali 671003, China)

Lowry method, 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid ammonium salt (ANS) fluorescence probe, circulardichroism and fluorescence spectroscopy were applied to explore the solubility, surface hydrophobicity, secondary structureand tertiary structure of glycinin at different pH conditions with the aim to provide the theoretical basis for the research onrelationship between soybean protein structure and surface hydrophobicity. The results showed that the transformation fromβ-sheet structure and random coil toα-helix structure occurred, and the microenvironment polarity of Trp residues revealedan obvious decrease with increasing pH. A negatively linear correlation between the surface hydrophobicity and solubilityof glycinin was observed, and the surface hydrophobicity of glycinin was also negatively correlated with the content ofα-helix structure.

glycinin; pH; structure; surface hydrophobicity

TS201.2

1002-6630（2015）11-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201511001

2014-12-23

國家自然科學基金面上項目（31071493）

魏冬旭（1983—），女，工程師，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：w22547800@hotmail.com

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com