于海霞，李 露，馬慧芬，張紅芬，陳安家(山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原03000;山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;通訊作者，E-mail:chenanjia888@63．com;共同通訊作者，E-mail:zhanghf_007@6．com)

螺內(nèi)酯片是一種弱的保鉀利尿藥，主要用于水腫性疾病、高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥、低鉀血癥的預(yù)防等。其主要成分螺內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)與醛固酮相似，可與醛固酮競(jìng)爭(zhēng)遠(yuǎn)曲小管及集合管細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的醛固酮受體，進(jìn)而影響醛固酮和受體結(jié)合，從而阻礙醛固酮誘導(dǎo)蛋白的合成，抑制K+-Na+交換，使鉀的排出減少，可起到保鉀利尿作用［1］。

螺內(nèi)酯片的主要成分螺內(nèi)酯又名安體舒通、螺旋內(nèi)酯，分子式為C24H32O4S，為白色或類白色細(xì)微結(jié)晶性粉末，無臭或有輕微硫醇臭，微有苦味。不溶于水，溶于乙醇，易溶于苯或醋酸乙酯，極易溶于氯仿，熔點(diǎn) 207-208 ℃，其結(jié)構(gòu)如圖 1［2］。

圖1 螺內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of spironolactone

通過系統(tǒng)地查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的螺內(nèi)酯含量測(cè)定方法多采用 HPLC 法［2，3］，尚未見用毛細(xì)管電泳法對(duì)螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道?？紤]到毛細(xì)管電泳技術(shù)在藥物分析方面具有高效、快速、分離效能高、進(jìn)樣量少、污染小及應(yīng)用越來越廣泛等優(yōu)點(diǎn)［4］，本文采用毛細(xì)管電泳法對(duì)市售螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試劑

無水甲醇和乙腈均為分析純，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，二水磷酸二氫鈉，超純水，螺內(nèi)酯片(浙江杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào):T14J048、T10J504;上海信誼藥廠有限公司，批號(hào):046140702)，螺內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。P/ACE MDQ貝克曼庫爾特毛細(xì)管電泳儀［貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司］，SB-120DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，PHS-3G型PH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，F(xiàn)A2004電子天平(上海衡平儀器儀表廠);

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品溶解性的考察

螺內(nèi)酯屬于內(nèi)酯類，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，故溶解時(shí)用甲醇而不能用水作為溶劑。實(shí)驗(yàn)采用無水甲醇20 ml溶解螺內(nèi)酯片后用pH 6．5濃度為0．02 mol/L的磷酸鹽緩沖液定容至100 ml，溶液無混濁;若供試品溶液中不加上述緩沖液，峰拖尾嚴(yán)重。故實(shí)驗(yàn)選擇使用無水甲醇20 ml溶解螺內(nèi)酯片后用 pH 6．5濃度為0．02 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋定容至100 ml，搖勻后靜置，待淀粉等輔料沉淀后樣品溶液澄清透明。每次進(jìn)樣前吸取上清液并用0．45 μm 微孔濾膜過濾。

2．2 溶液的配制

2．2．1 緩沖溶液的配制 精密稱取二水磷酸二氫鈉適量，配制成濃度為0．20 mol/L的儲(chǔ)備液。取適量磷酸鹽儲(chǔ)備液加入適量CTAB及乙腈配制成含0．004 mmol/L CTAB、20% 乙腈及 0．020 mol/L 磷酸二氫鈉的磷酸鹽緩沖液，搖勻，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6．5，即得所需電泳緩沖液Ⅰ。量取適量?jī)?chǔ)備液加水配制成濃度為0．020 mol/L磷酸鹽緩沖液，用NaOH調(diào)pH至6．5，得到用于稀釋樣品和對(duì)照品的緩沖液Ⅱ。

2．2．2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取螺內(nèi)酯對(duì)照品適量，用少量無水甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，繼續(xù)用無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制得到0．54 mg/ml的溶液作為螺內(nèi)酯儲(chǔ)備液。精確量取一定量?jī)?chǔ)備液于容量瓶中，加入pH 6．5的緩沖液Ⅱ，定容，搖勻，得20 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2．2．3 供試品溶液的配制 每個(gè)批號(hào)的螺內(nèi)酯分別取20片，精密稱定，研成粉末，精密稱取適量(約相當(dāng)于螺內(nèi)酯50 mg)，置于50 ml燒杯中，加入無水甲醇20 ml，超聲30 min使樣品完全溶解，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，加pH 6．5的緩沖液Ⅱ至刻度，搖勻，得供試品儲(chǔ)備液。精密量取5 ml儲(chǔ)備液于25 ml容量瓶中，加入pH 6．5緩沖液Ⅱ，定容，即得供試品溶液。

2．3 電泳條件的選擇

2．3．1 緩沖液濃度的選擇 離子強(qiáng)度可以影響樣品的遷移速度、電流強(qiáng)度及峰寬，離子強(qiáng)度越大，遷移速度越小，電流越大。而電流增大會(huì)使產(chǎn)熱增加，引起焦耳熱效應(yīng)使譜帶展寬。離子強(qiáng)度過低會(huì)使擴(kuò)散增加，也會(huì)導(dǎo)致峰展寬，而且電泳能力降低;過低的離子強(qiáng)度也會(huì)使pH的穩(wěn)定性下降。緩沖液的濃度直接影響離子強(qiáng)度，所以要選擇合適的緩沖液濃度。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后，以濃度為0．020 mol/L的緩沖液最佳。不同濃度緩沖液時(shí)電泳峰形見圖2。

2．3．2 緩沖液pH的選擇 緩沖溶液pH可以改變電滲流從而影響樣品的遷移時(shí)間，還可以影響樣品解離度進(jìn)而影響檢測(cè)靈敏度，所以緩沖溶液的pH是影響電泳分析的重要因素［4］。故分析時(shí)要根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇pH。本文考察了pH范圍在4．5-9．0的磷酸二氫鈉(0．020 mol/L)緩沖液，結(jié)果表明:樣品在pH 6．5時(shí)峰形最好，且遷移時(shí)間適中。當(dāng)pH＜6．5或＞6．5時(shí)峰拖尾嚴(yán)重，故實(shí)驗(yàn)選擇pH為6．5的緩沖液。不同pH緩沖液時(shí)的峰形見圖3。

2．3．3 改性劑的選擇 有機(jī)溶液加入到緩沖液中可以改變電滲流、改善峰形。采用pH 6．5，濃度為0．020 mol/L的緩沖液時(shí)峰有輕微的拖尾，經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在緩沖液中加入20%乙腈可以明顯改善拖尾，但不能改善前沿峰。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是一種陽離子表面活性劑，它可以降低樣品吸附從而改善拖尾，并且可以控制電滲流以提高重現(xiàn)性。但是CTAB的濃度要在臨界膠束濃度(9．2 ×10-4mol/L)以下［5-9］，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度為0．004 mmol/L時(shí)效果最佳。

圖2 不同濃度緩沖液電泳圖譜對(duì)比Figure 2 Electrophoretogram of different concentrations of buffer solutions

圖3 不同pH緩沖液電泳圖譜對(duì)比Figure 3 Electrophoretogram of different pH buffer solutions

2．3．4 波長(zhǎng)的選擇 應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)螺內(nèi)酯進(jìn)行在線檢測(cè)，在190-400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在244 nm處吸收最大、峰形最好。故采用244 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2．3．5 電壓的選擇 電壓的大小可以影響樣品的遷移時(shí)間和峰形［10，11］。實(shí)驗(yàn)分別選擇 15 kV、20 kV、25 kV作為分離電壓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電壓為15 kV時(shí)樣品的遷移時(shí)間過長(zhǎng);25 kV時(shí)遷移時(shí)間較短但電流增大峰形變差;20 kV時(shí)峰形較好且遷移時(shí)間不是很長(zhǎng)。故實(shí)驗(yàn)選擇20 kV作為分析電壓。

2．4 毛細(xì)管電泳條件

采用貝克曼P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀。未涂層毛細(xì)管柱(75 μm ×57 cm，有效長(zhǎng)度10．2 cm);運(yùn)行緩沖液為含有20%的乙腈和0．004 mmol/L的CTAB的，20 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，pH為6．5;分析電壓為20 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為244 nm。

2．5 線性關(guān)系的考察

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別加pH 6．5緩沖液Ⅱ稀釋至 2 ml，搖勻，得到 1．62，7．56，15．12，19．98，59．94，119．9 μg/ml的螺內(nèi)酯溶液，對(duì)應(yīng)編號(hào)1-6號(hào)，在上述毛細(xì)管電泳條件下進(jìn)行測(cè)定。

以螺內(nèi)酯濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得回歸曲線，回歸方程為Y=877．7X+4 238(r2=0．991 6)。結(jié)果表明在 1．62-119．9 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖 4)。

2．6 精密度試驗(yàn)

精密吸取線性關(guān)系考察試驗(yàn)中的5號(hào)對(duì)照品溶液適量，在上述電泳條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積的RSD為1．1%，表明儀器的精密度良好。

2．7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)螺內(nèi)酯片(批號(hào):046140702)，按照2．2．3項(xiàng)下的方法平行配制6份供試品溶液，在上述電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，分別求出螺內(nèi)酯的含量，計(jì)算得RSD為3．4%。表明本法的重復(fù)性較好。

圖4 螺內(nèi)酯工作曲線Figure 4 Calibration curve of spironolactone

2．8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào):046140702)，分別于配制后0，2，4，6，8 h在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，螺內(nèi)酯峰面積的RSD為2．3%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．9 加樣回收率試驗(yàn)

在已知含量的供試品溶液(批號(hào):046140702)中，精密加入一定量的對(duì)照品溶液使成高、中、低三個(gè)不同濃度的供試品溶液，在上述電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，求得螺內(nèi)酯的回收率為91．2%-106．6%。

表1 螺內(nèi)酯的加樣回收率Table 1 Sample recovery rate of spironolactone

2．10 供試品中螺內(nèi)酯的含量測(cè)定

按2．2．3項(xiàng)下的方法配制三種批號(hào)的供試品溶液，在上述電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯的含量測(cè)定 (n=3)Table 2 Contents of spironolactone in spironolactone tablets(n=3)

上述測(cè)定結(jié)果顯示，2個(gè)批號(hào)(T14J048和046140702)的螺內(nèi)酯片中螺內(nèi)酯的含量符合原衛(wèi)生部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-2411-97)的要求;批號(hào)T10J504由于已過保質(zhì)期，從結(jié)果可以看出含量偏低，說明隨著藥品存放時(shí)間的延長(zhǎng)，螺內(nèi)酯的含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化的樣品制備條件及電泳條件下對(duì)螺內(nèi)酯片劑進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明螺內(nèi)酯片劑的含量可在此條件下獲得。由系統(tǒng)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和樣品含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出該法精密度、穩(wěn)定性良好，測(cè)定準(zhǔn)確，并且毛細(xì)管電泳測(cè)定的方法較之高效液相的方法簡(jiǎn)便、快速、分析成本低且污染較小，可作為螺內(nèi)酯制劑中螺內(nèi)酯的質(zhì)量控制方法。

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