雷 萍，吳亞召，張文雋，宋延平，杜 芳，楊 潔，謝婷婷，李玲梅

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安 710043;2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西西安 712000)

腫瘤是在各種致癌因素作用下，機(jī)體在基因水平上局部組織的某一個(gè)細(xì)胞失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。目前，腫瘤的治療方法主要有以下幾類:外科治療，腫瘤的外科治療即手術(shù)治療，是治療某些腫瘤的最有效的方法，是腫瘤治療較為傳統(tǒng)的方法之一，化療和放療，化療是用化學(xué)藥物［1］進(jìn)行治療，屬于腫瘤的全身治療方法，放療，俗稱“烤電”“照光”，是利用電離輻射來治療腫瘤的一種方法;生物療法，是通過生物反應(yīng)修飾劑(BRM)對腫瘤進(jìn)行治療，反應(yīng)修飾劑主要包括細(xì)胞因子、免疫活性細(xì)胞、單克隆抗體及其偶聯(lián)物、腫瘤分于疫苗等;中醫(yī)藥治療腫瘤，中醫(yī)藥治療運(yùn)用整體觀念、正邪學(xué)說、辯證理論等高度概括了腫瘤的發(fā)病機(jī)理和病程轉(zhuǎn)歸，對腫瘤的治療起著重要的指導(dǎo)意義。在這幾種主要治療方法中，中醫(yī)藥治療腫瘤越來越受到人們的重視。

桑黃菌(Phellinus ignairius)又名裂蹄木層孔菌，是一種多年生珍貴藥用真菌［2-3］。子實(shí)體單生，主要生長于桑樹、楊樹、白樺樹等闊葉樹的枯立木樹干上［4］。桑黃寄生樹種不同，顏色、形狀以及所含有效活性成分亦不同［5］。桑黃菌味微苦，桑黃子實(shí)體具很好的抗癌活性，含落葉松蕈酸、麥角甾醇等。日本人 Ikekaw T等［6］在1968年發(fā)現(xiàn)，桑黃野生子實(shí)體的水提取物對小鼠肉瘤S180的抑制率為 96.7%，Sasaki T［7］等發(fā)現(xiàn)桑黃發(fā)揮抗癌作用的單體物質(zhì)為多糖，桑黃多糖具有促使腫瘤細(xì)胞自我毀滅的誘導(dǎo)細(xì)胞自殺活性作用，可以防止腫瘤細(xì)胞附著于體內(nèi)，同時(shí)擁有腫瘤轉(zhuǎn)移作用［8］。溫克［9］等人以小鼠胃癌和 S180肉瘤為模型，研究比較桑黃、靈芝、阿加里斯茸PL-2，PL-5的抗癌活性，結(jié)果顯示桑黃在4種藥物中有較好的抑瘤作用，分別為43.09%和46.07%。桑黃是目前國際公認(rèn)的抗癌效果較好的大型真菌之一［10］。Ajijh.t.a等研究了桑黃乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，然后用來分別抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，發(fā)現(xiàn)水提物對它們沒有細(xì)胞毒素作用，而這3個(gè)提取物對DLA引起的小鼠腫瘤細(xì)胞有著顯著的生長抑制作用。桑黃產(chǎn)品作為抗腫瘤藥物具有極大的藥用價(jià)值和開發(fā)潛力［11］。桑黃菌絲體可通過發(fā)酵工程大規(guī)模生產(chǎn)，克服子實(shí)體資源匱乏的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與瘤株

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級KM小鼠，50×3只，雌性或雄性，體重20±2g，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物合格證號:0012286;0012296;0011714。

所有實(shí)驗(yàn)動物均給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，實(shí)驗(yàn)在二級動物室進(jìn)行，凈化室溫度在20～25℃;相對濕度在40% ～70%。門窗密閉，使用空氣凈化系統(tǒng)，送新風(fēng)全口開啟，送風(fēng)機(jī)隔日換機(jī)一次，人流和廢棄物等按規(guī)定的方向運(yùn)行，不得逆轉(zhuǎn)。試驗(yàn)結(jié)束后，對處死動物的尸體、垃圾袋裝后及時(shí)清理。

1.1.2 瘤株 小鼠H22肉瘤細(xì)胞:由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)，解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試驗(yàn)藥物

100%桑黃菌絲體(陜西省微生物研究所菌種資源中心三室，批號20121010)。注射用環(huán)磷酰胺(國藥準(zhǔn)字H14023686，批號04120101，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。

1.3 主要儀器設(shè)備

BS210S電子天平(精確度0.1 mg，北京賽多利斯天平廠)。XSZ-D2 9818504顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。TDL-4型低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)等。

1.4 劑量設(shè)置及配制

桑黃菌絲體急毒的最大耐受量是15 g/kg，取其1/5作為中劑量，即3.0 g/kg，加一倍為大劑量6.0 g/kg，減一倍為小劑量1.5 g/kg。稱取桑黃菌絲粉末6 g，加蒸餾水至20 mL配制成30%桑黃菌絲體混懸液，為大劑量，稀釋成為15%，7.5%為中、小劑量，給藥體積均為0.2 mL/10 g。環(huán)磷酰胺(CTX):按20 mg/kg劑量灌胃給藥。

1.5 H22實(shí)體瘤小鼠模型的制備

取凍存的肝癌H22細(xì)胞瘤株，常規(guī)復(fù)蘇，用PBS調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為1×107/mL，取0.5 mL(活細(xì)胞數(shù)為5×106)接種于3只小鼠腹腔內(nèi)，約一周后小鼠出現(xiàn)癌性腹水。待癌性腹水長至7～10 d后無菌抽取癌性腹水，PBS洗滌2次，每次2 000 r/min，離心10 min。離心后棄上清液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，吹打混勻后備用。按0.2 mL/只接種于小鼠右腋皮下，即為小鼠H22實(shí)體瘤模型。需注意配置細(xì)胞懸液到小鼠接種完成需在冰域中進(jìn)行，并在1 h內(nèi)完成。

1.6 動物分組

接種H22瘤細(xì)胞后24h，將動物隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型對照組、陽性藥對照組(CTX)、桑黃菌絲體大、中、小劑量組。

1.7 給藥劑量

模型對照組按0.2 mL/10 g灌胃給予純凈水，1次/d;陽性對照組按劑量20㎎/㎏灌胃給予環(huán)磷酰胺(CTX)，體積為0.2 mL/10 g，1次/d;桑黃菌絲體按上述濃度體積給藥，1次/d，連續(xù)給藥10次。

1.8 測定荷瘤小鼠抑瘤率

末次給藥后24h內(nèi)用拉脫頸椎法處死動物，稱重，解剖取瘤，計(jì)算腫瘤抑制率。

腫瘤抑制率%=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

按上述方法重復(fù)3批試驗(yàn)，以驗(yàn)證藥物抑瘤效果。每批應(yīng)用不同性別的動物以消除性別差異的影響，但同一批次的動物必須使用同一性別。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果見表1-表4，結(jié)果表明，除環(huán)磷酰胺陽性組第一、第三批及3批平均小鼠體重增長明顯低于模型組外(P＜0.01)，試驗(yàn)其余各組動物體重均勻增長，模型組腫瘤生長良好。桑黃菌絲體6.0 g/kg，3.0 g/kg，1.5 g/kg 劑量組及環(huán)磷酰胺組3批小鼠H22實(shí)體瘤生長均明顯低于對照組(P＜0.01或 P＜0.05)，平均抑制率分別為43.6% ，36% ，26% ，57.2% 。

表1 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用(±S)第1批♀Tab.1 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The first batch♀

表1 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用(±S)第1批♀Tab.1 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The first batch♀

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01

組 別 動物(只)(始/末) 動物體重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型組28.24 10/10 20.9±1.1/26.2±3.0 1.01±0.12 -CTX組 10/10 20.5±0.7/22.2±0.8＊＊ 0.43±0.17＊＊ 57.20大劑量組 10/10 20.8±1.0/24.2±2.7 0.56±0.14＊＊ 44.37中劑量組 10/10 20.4±0.5/24.8±3.7 0.65±0.13＊＊ 34.81小劑量組 10/10 20.7±1.2/24.8±2.1 0.71±0.10＊＊

表2 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用(±S)第2批♂Tab.2 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The second batch♂

表2 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用(±S)第2批♂Tab.2 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice( ± S)The second batch♂

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01

組 別 動物(只)(始/末) 動物體重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型組 10/10 20.3±0.9/25.1±3.0 1.12±0.14—27.28 CTX組 10/10 19.8±0.8/23.3±0.9 0.37±0.09＊＊ 65.85大劑量組 10/10 20.0±0.8/25.4±3.2 0.66±0.22＊＊ 40.12中劑量組 10/10 20.0±0.9/26.9±2.5 0.70±0.12＊＊ 36.92小劑量組 10/10 20.0±0.7/26.1±2.2 0.81±0.14＊＊

表3 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用±S)第3批♀Tab.3 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice(± S)The third batch♀

表3 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用±S)第3批♀Tab.3 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22 tumor-bearing mice(± S)The third batch♀

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01

images/BZ_91_333_2875_2142_2950.png模型組22.84 10/10 19.5±0.8/23.5±2.2 0.90±0.12 -CTX組 10/10 19.5±0.7/21.0±1.5＊＊ 0.40±0.13＊＊ 55.52大劑量組 10/10 19.8±0.6/24.3±1.2 0.48±0.09＊＊ 46.18中劑量組 10/10 20.2±0.8/24.0±1.3 0.52±0.06＊＊ 41.41小劑量組 10/10 19.9±0.7/23.7±1.3 0.69±0.08＊＊

表4 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用±S)(合計(jì))Tab.4 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22tumor-bearing mice ± S)(Total)

表4 桑黃菌絲體對荷H22小鼠實(shí)體瘤的抑制作用±S)(合計(jì))Tab.4 Inhibitory effect of Phellinus myceliumr on H22tumor-bearing mice ± S)(Total)

注:與模型組比較:＊＊ P＜0.01，*P＜0.05

組別 動物(只)(始/末) 動物體重/g(始/末) 瘤重/g 抑制率/%模型組26.12 30/30 20.2±1.1/24.9±2.9 1.01±0.15 -CTX組 30/30 19.9±0.8/22.2±1.4＊＊ 0.40±0.13＊＊ 59.52大劑量組 30/30 20.2±0.9/24.6±2.5 0.57±0.17＊＊ 43.56中劑量組 30/30 20.2±0.8/25.2±2.9 0.62±0.13＊＊ 37.71小劑量組 30/30 20.2±0.9/24.9±2.1 0.74±0.12＊＊

3 結(jié)論

試驗(yàn)期間無小鼠死亡，模型組腫瘤生長良好，本品連續(xù)給小鼠灌胃給藥，3批試驗(yàn)對荷H22小鼠實(shí)體瘤的平均抑瘤率達(dá)到30%以上，且重復(fù)性良好，說明桑黃菌絲體對小鼠H22實(shí)體瘤有明顯的抑制作用。

［1］ 張萬國，胡晉紅，蔡溱，等.桑黃抗犬鼠肝纖維化與抗脂質(zhì)過氧化［J］.中成藥，2002，24(4):281.

［2］ 卯曉嵐.中國大型真菌［M］.鄭州:河南科技出版社，2000:465-468;477.

［3］ 雷萍，孫悅迎，張文雋，等.野生桑黃菌種分離與培養(yǎng)特性研究初報(bào)［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2007，14(2):71-75.

［4］ DAI Y C.Phellinus sensu lato(Aphyllophorales，Hymenochaetaceae)in East Asia［J］.Acta Bot Fennici，1999，166:111-115.

［5］ 宋力，孫培龍，郭杉杉，等.桑黃的研究進(jìn)展［J］.中國食用菌，2004，24(3):7-15.

［6］ IKEKAWA T，NAKANISHI M，UEHARA N，et al.Antitumor action of some Basidiomycetes，especially Phllinus linteus［J］.Gann，1968，59(2):155.

［7］ SASAKI T，ARAI Y，IKEKAWA T，et al.Antitumor polysaccharides from some polyporaceae，Ganoderma applanatum(Pers.)Pat and Phellinus linteus(Berk.Et Curt)Aoshima［J］.Chem.Pharm.Bull，1971，19(4):821-826.

［8］ 傅海慶.桑黃多糖的研究進(jìn)展［J］.包裝與食品機(jī)械，2008，26(5):32-36.

［9］ 溫克，陳勁，李紅.桑黃等四種抗癌藥物抗癌活性比較［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2002，28(3):247-249.

［10］雷萍，吳亞召，張文雋，等.秦巴山區(qū)桑黃18SrDNA的序列與親緣關(guān)系分析［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，42(4):620-622.

［11］雷萍，張文雋，吳亞召，等.秦巴山區(qū)野生桑黃人工馴化栽培技術(shù)研究初報(bào)［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，44(1):71-74.