黃碧蘭 張玄兵 范紅霞

摘 要 利用根尖壓片法對懸鈴花進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明：懸鈴花體細(xì)胞的染色體數(shù)為2n=28， 相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S，核型不對稱系數(shù)為：59.95%；其核型公式為：20m+8sm，屬2B核型。為今后錦葵科懸鈴花屬植物核型分析研究提供一定的借鑒和依據(jù)。

關(guān)鍵詞 懸鈴花 ；染色體 ；核型分析

分類號 S68

懸鈴花，別名大紅袍、卷瓣朱槿、南美朱槿，屬常綠小灌木。往往逸為野生，華南地區(qū)多植于庭院。懸鈴花形似風(fēng)鈴，美麗可愛，為不可多得的盆栽佳品，也是園林造景中常用的灌木植物，形態(tài)優(yōu)美，花色艷麗，花期較長，具有極高的觀賞價(jià)值。染色體是生物遺傳物質(zhì)的載體，染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)反映了一個(gè)物種的基本特征。植物染色體核型分析對于研究植物的系統(tǒng)演化、起源、物種間親緣關(guān)系及遠(yuǎn)緣雜交等方面都有著重要的意義。從目前研究狀況來看，國內(nèi)外對懸鈴花的染色體核型研究尚未見報(bào)道。為此，本文以懸鈴花為研究對象，通過懸鈴花染色體核型分析，探索懸鈴花的細(xì)胞遺傳特征，為懸鈴花的分類、雜交育種、品種改良提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以栽培懸鈴花作為研究對象，溫室栽培，室內(nèi)處理。早上8：00～10：00溫室取材。

1.2 方法

以常規(guī)壓片法制備染色體標(biāo)本，以李懋學(xué)，陳瑞陽[1]的核型分析方法為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

1.2.1 取材

等懸鈴花花的根長至1.0～1.5 cm 時(shí)，選取飽滿、健壯的根尖，截取2～3 mm。

1.2.2 預(yù)處理

預(yù)處理的目的是阻止或破壞紡垂體微管的形成，累計(jì)比較多的處于細(xì)胞分裂中期的染色體圖象。同時(shí)促進(jìn)染色體濃縮變短、改變胞質(zhì)粘度，促進(jìn)染色體清晰及細(xì)胞質(zhì)清潔，便于觀察。所以預(yù)處理是否適宜，是染色體制片技術(shù)中最關(guān)鍵的操作步驟。本試驗(yàn)采用了0.002～0.004 mol/L的8羥基處理的方法，處理時(shí)間為2～3 h[2-4]。

1.2.3 固定

預(yù)處理后將根尖用蒸餾水清洗干凈后轉(zhuǎn)入改良的卡諾氏固定液。用卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）置4℃或常溫對材料處理2～24 h[5-7]。

1.2.4 解離

采用酸解法，將固定好的材料用蒸餾水清洗10 min，解離液用1 mol/L 鹽酸在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱5～10 min[8-9]。

1.2.5 染色

將解離好的根尖用蒸餾水沖洗凈后就可進(jìn)行染色了，在洗滌時(shí)一定要將材料中殘留的鹽酸溶液徹底清洗干凈，否則不利于染色。染色劑選用卡寶品紅染液，染色時(shí)間為12、24、36 h，最后確定染色效果最好的時(shí)間。

1.2.6 制片

采用常規(guī)壓片法進(jìn)行制片。用鑷子夾取一個(gè)根尖放置在載玻片上，然后滴上一滴45%的醋酸，蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕敲打蓋玻片，使細(xì)胞和染色體分散開來[9]。敲完后再放酒精燈上微熱5～10 s，最后再輕壓一下玻片。壓片時(shí)要注意控制力度不要敲碎蓋玻片，同時(shí)要保證蓋玻片和載玻片不發(fā)生滑動。

1.2.7 鏡檢

在顯微鏡下觀察制片，選擇染色體分散較好的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，并且拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理效果

實(shí)驗(yàn)表明，用0.002 mol/ L 的8-羥基喹啉水溶液處理懸鈴花根尖材料2.0 h ，在流動的自來水中處理并不斷振蕩，期間更換一次新鮮溶液，這樣的制片效果比較好，可以得到較多染色體形態(tài)清晰、收縮較好的中期分裂相細(xì)胞。

2.2 固定時(shí)間

實(shí)驗(yàn)表明，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，可以更清楚的表現(xiàn)出染色體的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2.3 解離時(shí)間

實(shí)驗(yàn)表明，用0.002 mol/L 8羥基喹啉水溶液處理根尖2.0 h后，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，再在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)解離10 min，根尖軟化程度較好，壓片時(shí)細(xì)胞易分散，染色體形態(tài)自然，細(xì)胞背景清晰。解離5 min ，根尖軟化程度不夠，細(xì)胞難以壓散，觀察時(shí)不夠清晰；解離15 min以上，材料又過度軟化，細(xì)胞容易被壓碎，壓片時(shí)常造成染色體丟失，不便于統(tǒng)計(jì)。

2.4 染色效果

卡寶品紅對染色體的染色效果，與鹽酸的解離條件密切相關(guān)，不同的植物需要不同的解離條件。實(shí)驗(yàn)表明。將懸鈴花根尖材料在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)解離10 min后染色，效果較好，這時(shí)染色體呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)無色或只有極淡的紅色。

2.5 制片效果

實(shí)驗(yàn)表明，蓋蓋玻片時(shí)應(yīng)傾斜下放，盡量不留氣泡在蓋片內(nèi)。敲片時(shí)用力要均勻、適度，以防敲碎蓋玻片。壓片時(shí)手的力氣要朝一個(gè)方向，這樣的制片染色體比較分散且無重疊現(xiàn)象，易于觀察。

2.6 鏡檢過程

實(shí)驗(yàn)表明，在鏡檢過程中先用20倍鏡觀察，看到比較清晰的后轉(zhuǎn)入40倍鏡，最后用100倍的油鏡拍照。在整個(gè)過程中，用100倍鏡滴香柏油時(shí)需特別小心，用量要少，防止香柏油進(jìn)入玻片內(nèi)沖走染色體。

通過AutoCAD 2004 Chs、Adobe Photoshop CS、Microsoft Excel、Microsoft Word等軟件及工具得出數(shù)據(jù)和圖。見表1和圖1、2、3。

由表1可得出以下結(jié)論：

（1）染色體數(shù)目：2n=2x=28

（2）核型公式：20m+8sm

（3）相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S

（4）核型不對稱系數(shù)為：59.95%

（5）最長染色體/最短染色體之比為：2.171

（6）臂比大于2 的染色體比例為：0.071

（7）細(xì)胞類型為：2B

2.7 核型的組成

選取2個(gè)染色體分散較好、形態(tài)較清晰的懸鈴花中期染色體分裂相細(xì)胞進(jìn)行核型分析。懸鈴花的核型模式見圖1，懸鈴花染色體的模式照片見圖2。結(jié)果表明，懸鈴花體細(xì)胞的染色體數(shù)為2n=28。在懸鈴花的14對染色體中，具近中部著絲點(diǎn)4對；具中部著絲點(diǎn)10對。其核型公式為：20m+8sm，其核型圖見圖3。

2.8 核型類型

懸鈴花的最長染色體/最短染色體之比是2.171，因此根據(jù)Stebbins[10]的劃分標(biāo)準(zhǔn)可以得出：懸鈴花的細(xì)胞類型為2B

2.9 染色體相對長度系數(shù)組成

根據(jù)染色體相對長度系數(shù)（Index of relative length， I. R. L），I.R.L=染色體長度/全組染色體平均長度組成劃分[11]，即I.R.L≥1.26為長染色體（L）；1.01≤I.R.L≤1.25為中長染色體（M2）；0.76≤I.R.L≤1.00為中短染色體（M1）；I.R.L<0.76為短染色體（S）。由此可得懸鈴花有1對長染色體，5對中長染色體，4對中短染色體和3對短染色體。

2.10 核型不對稱系數(shù)

核型不對稱系數(shù)[A sk=（長臂總長/全組染色體總長）×100%]，其比值愈大愈不對稱。本實(shí)驗(yàn)測得懸鈴花的染色體核型不對稱系數(shù)為59.95，比較對稱。

研究證明，高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展，系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物，往往具有較對稱的核型，而不對稱的核型則通常出現(xiàn)在較進(jìn)化或較特化的植物中。按Stebbins劃分標(biāo)準(zhǔn)，1A最對稱，4C最不對稱。根據(jù)這個(gè)觀點(diǎn)，懸鈴花為2B，應(yīng)該屬于較對稱核型，實(shí)驗(yàn)證明亦是如此。由此可見，懸鈴花在同屬植物中屬于相對原始的植物。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：根尖取樣以早上8：00～10：00溫室取材為佳，切取根尖2～3 mm，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉預(yù)處理2 h（處理期間振蕩指形管更換一次溶液并置于流動的自來水中），用改良的卡諾氏固定液固定24 h，用1 mol/L HCL在（60±1）℃水浴鍋中解離10 min，用卡寶品紅染色24 h，效果較好。結(jié)果顯示：懸鈴花體細(xì)胞的染色體數(shù)為2n=28；相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S；核型不對稱系數(shù)為：59.95%；其核型公式為：20m+8sm，細(xì)胞類型為2B。Levitsky[12]、Stebbins[13]曾指出，在系統(tǒng)演化上，處于較古老的或原始的植物具有對稱的核型，而不對稱核型往往出現(xiàn)在進(jìn)化水平較高或特化的植物中，親緣關(guān)系比較近的物種往往具有較相似的核型。所以懸鈴花在核型進(jìn)化上應(yīng)屬于較原始的核型類型。已有研究表明，生物的進(jìn)化是復(fù)雜的、多方向和多樣化的，在已知的某些科、屬內(nèi)，核型并不完全表現(xiàn)為由對稱向不對稱進(jìn)化，而有可能表現(xiàn)為由不對稱向?qū)ΨQ進(jìn)化[14]。懸鈴花植物的進(jìn)化屬于何種，有待于進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李懋學(xué)，陳瑞陽. 關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題[J]. 武漢植物學(xué)研究，1985（04）：297-302.

[2] 任 琛，孫景景，袁 瓊. 蟛蜞菊屬和孿花菊屬（菊科——向日葵族）的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2012，20（2）：107-113.

[3] 時(shí)麗冉，王 晶，崔興國. 紫穗槐核型分析方法的探討[J]. 北方園藝，2009（2）：53-55.

[4] 王 勝，張春發(fā)，鄧柳紅. 紫萬年青的核型分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（2）：327-331.

[5] 丁 鴻，邱東萍，陳少雄. 植物染色體標(biāo)本的制備和染色體核型分析研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43 （12）：1 958-1 962.

[6] 林秀琴，蔡 青，陸 鑫. 甘蔗根尖染色體制片技術(shù)研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011（27）：104-108.

[7] 詹秋文，高 麗，張?zhí)煺? 蘇丹草與高粱染色體核型比較研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15（2）：100-106.

[8] 李娟娟，王 蕾，賈俊忠. 黃瓜正常品種及一個(gè)芽黃突變體的核型分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（2）：296-300.

[9] 鄧果特. 中國芒屬植物染色體核型與倍性研究[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012

[10] 洪德元. 植物分類學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990，30.

[11] 鄭金雙，張蜀寧，孫成振. 不結(jié)球白菜根尖體細(xì)胞染色體制片及其二倍體和四倍體有絲分裂過程觀察[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（4）：58-63.

[12] Arano H. Gytological studies in subfamily Carduoideae （Compositaeof Japan IX[J]. BotMag （Tokyo），1963（76）： 32-39.

[13] Stebbins G L. Chromosomal Evolution in Higher Plants[M]. London： Edward Arnold L TD， 1971： 85-105.

[14] 冷青云，莫 饒. 三褶蝦脊蘭的核型分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2008，16（2）：165-168.