路美玲，李建寧，魏春玲，劉一輝，任 維

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

大鼠坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷模型（Chronic Constriction Injury，CCI）［1］，作為一個經(jīng)典的疼痛動物模型，因其能夠產(chǎn)生節(jié)律模式豐富多樣的自發(fā)放電，已成為研究自發(fā)放電節(jié)律及其變化規(guī)律的常用模型.以往研究在低鈣條件下觀察到陣發(fā)周期節(jié)律、整數(shù)倍節(jié)律、周期簇放電、周期峰放電、混沌簇放電、混沌峰放電等放電節(jié)律，以及倍周期分岔、倍周期分岔序列到混沌、帶混沌的加周期分岔和帶有隨機節(jié)律的加周期分岔［2－6］等分岔轉(zhuǎn)遷模式.這些研究發(fā)現(xiàn)，降低灌流液鈣離子濃度或使用非特異性鉀通道阻斷劑四乙基銨（Tetraethylammonium，TEA）均可以誘發(fā)損傷神經(jīng)起步點呈現(xiàn)自發(fā)放電節(jié)律的轉(zhuǎn)遷，并且低鈣和TEA誘發(fā)的轉(zhuǎn)遷歷程非常相似［12］.以上結(jié)果提示，鈣激活鉀通道可能參與損傷神經(jīng)自發(fā)放電的調(diào)節(jié).由于TEA是非特異的鉀通道阻斷劑，上述推論仍缺乏直接的藥理學(xué)證據(jù).

鈣激活鉀通道（Ca2＋-activated K＋channel，Kca）根據(jù)電導(dǎo)的大小可分為小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（The small-conductance Ca2＋-activated K＋channel，SK，2-25pS）、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道（The medium-conductance Ca2＋-activated K＋channel，IK，25-100pS）和大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（The large-conductance Ca2＋-activated K＋channel，BK，100-300pS）［13］.BK通道由四個α亞單位構(gòu)成的主體及附屬的β調(diào)節(jié)亞單位（β1～β4）組成，是電壓和Ca2＋依賴的離子通道.細胞內(nèi)鈣和膜去極化都可激活BK通道，在神經(jīng)元細胞上BK主要參 與 快 速 后 超 極 化 （fast after-hyperpolarization，fAHP）電流的形成，抑制了神經(jīng)元沖動的發(fā)放［7］.背根節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元上激活BK通道使DRG神經(jīng)元動作電位的時程縮短，動作電位的爆發(fā)頻率降低［8］.BK通道可被蝎毒（Iberiotoxin，IBTX）特異性阻斷［9］、TEA非特異性阻斷［10］.功能性SK通道包括兩種亞單位:α亞基和與之相連的鈣調(diào)蛋白（CaM）亞基，是Ca2＋高敏感性和電壓不依賴的離子通道［11］.SK通道調(diào)節(jié)中等后超極化（medium ratehyperpolarization，ImAHP）電流和慢速后超極化（small rate-hyperpolarization，IsAHP）電流，降低神經(jīng)元興奮性，限制神經(jīng)元的放電頻率，產(chǎn)生放電頻率適應(yīng)［12－13］，可被蜂毒明肽（Apamin）特異性阻斷［14］.這些研究表明，BK、SK對動作電位的調(diào)節(jié)起著極其重要的作用.

本研究選取CCI模型大鼠的損傷坐骨神經(jīng)作為研究對象，利用細胞外非特異性鈣激活鉀通道阻斷劑TEA、BK通道特異性阻斷劑IBTX和SK通道特異性阻斷劑Apamin，研究其對損傷神經(jīng)放電頻率的影響；并重點觀察是否出現(xiàn)放電節(jié)律的變化及分岔轉(zhuǎn)遷；再仔細比較使用特異性阻斷劑和非特異性阻斷劑后的節(jié)律變化是否不同，觀察鈣激活鉀通道狀態(tài)改變對放電模式的影響，以及BK，SK通道在損傷神經(jīng)自發(fā)放電中的作用.

1 材料和方法

1.1 實驗方法

選用健康的成年雄性SD大鼠，由西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，體重150～300g，依照文獻所述，制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型［1］.用戊巴比妥鈉（40mg/kg，i.p）腹腔注射進行麻醉，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，分離出一段神經(jīng)干（1cm左右）再輕度結(jié)扎，形成一個對坐骨神經(jīng)外周區(qū)段的慢性壓迫.手術(shù)后3～7d，用烏拉坦腹腔注射麻醉手術(shù)后，再次將損傷區(qū)域暴露，去除結(jié)扎線、游離損傷區(qū)段的坐骨神經(jīng)，用34～35℃正常灌流液浸浴損傷區(qū)域.在距離損傷區(qū)域約20mm的中樞端處另行切口，可暴露出一段正常未受損傷的坐骨神經(jīng)，再用34～35℃溫熱石蠟油浸浴正常區(qū)段的神經(jīng)，在顯微鏡下分離出中樞端神經(jīng)細束，切斷它與中樞神經(jīng)的聯(lián)系，使其僅與損傷區(qū)域相連，將分離出的神經(jīng)細束放于鉑金絲引導(dǎo)電極上，用chart5.5軟件觀察并記錄神經(jīng)細束的自發(fā)放電情況.計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度以對神經(jīng)纖維進行分類.速度大于2m/s為A類神經(jīng)元，小于2m/s為C類神經(jīng)元［15］，若出現(xiàn)了單個A纖維放電則進行記錄保存，神經(jīng)電活動信號可經(jīng)powerlab系統(tǒng)放大、采集之后輸入計算機系統(tǒng)，采樣頻率是10.0 kHz.順序記錄相鄰動作電位峰峰間期時間間隔，獲得神經(jīng)自發(fā)放電峰峰間期（Inter-Spike Interval，ISI）序列，所得數(shù)據(jù)用origin軟件分析并作相應(yīng)的時間序列圖等.實驗中利用不同濃度的TEA、IBTX和Apamin替換正常灌流液灌流損傷區(qū)，分別記錄放電的ISI序列.

1.2 藥品

Apamin，IBTX，TEA購于Sigma公司.

1.3 實驗溶液

正常灌流液成分（mmol/L）:150NaCl、5KCl、1MgCl2、1.2CaCl2、10HEPES.

所用藥物濃度:TEA（40mmol/L），Apamin（100μmol/L），IBTX （20μmol/L），用正常灌流液稀釋得到.藥品溶于蒸餾水后，以1mol/L的NaOH或者 HCl調(diào)節(jié)pH值為7.35～7.45.

2 實驗結(jié)果

2.1 不同阻斷劑對自發(fā)放電頻率的影響

在實驗性神經(jīng)起步點，觀察不同的鈣激活鉀通道阻斷劑對放電頻率的影響.在非特異性阻斷劑TEA的作用下，60例數(shù)據(jù)均出現(xiàn)放電頻率增加（100%）；在BK特異性阻斷劑IBTX的作用下，28例數(shù)據(jù)中22例出現(xiàn)放電頻率的增加（78.6%）；在SK特異性阻斷劑Apamin的作用下，40例數(shù)據(jù)中有35例出現(xiàn)了放電頻率增加（87.5%）.加藥后25s與加藥前相比，3種藥物的施加均顯著提高了放電頻率（配對t檢驗，P＜0.01）.加藥后25s，TEA組的放電頻率遠高于IBTX組和Apamin組（獨立樣本t檢驗，P＜0.01），IBTX組和 Apamin組無顯著差異（圖1）.

圖1 在不同的Kca阻斷劑TEA、Apamin、IBTX的作用下放電頻率的變化Fig.1 Application of TEA，Apamin and IBTX caused significant increase in firing rate of injured nerves in the CCI model

2.2 不同阻斷劑對放電節(jié)律的影響

2.2.1 非特異性Kca阻斷劑TEA的自發(fā)放電依據(jù)分岔轉(zhuǎn)遷規(guī)律 TEA使放電從周期1開始逐漸向較高周期轉(zhuǎn)化，到簇內(nèi)含有多個峰的放電再經(jīng)過激變到達峰端.圖2顯示了1例有代表性的分岔過程.

圖2 TEA誘導(dǎo)的損傷神經(jīng)自發(fā)放電分岔序列Fig.2 The bifurcation scenario of an injured nerve fiber during application of TEA （［TEA］o increased from 0to 40mmol/L）

在1例神經(jīng)起步點（圖2），損傷神經(jīng)的自發(fā)放電在正常灌流液表現(xiàn)為陣發(fā)，調(diào)節(jié)TEA的濃度從0升高到40mmol的過程中，經(jīng)過周期1簇放電、周期2簇放電、周期2周期3混沌、周期3、高周期到達峰端周期1，說明在TEA的作用下，放電節(jié)律呈現(xiàn)出程度較大、較豐富的轉(zhuǎn)遷歷程，從簇端周期1經(jīng)過復(fù)雜的節(jié)律變化到達峰端周期1.上述結(jié)果提示在神經(jīng)損傷區(qū)可能存在Kca.

2.2.2 BK特異性阻斷劑IBTX使自發(fā)放電呈現(xiàn)部分節(jié)律轉(zhuǎn)遷 在IBTX的作用下，放電僅呈現(xiàn)部分節(jié)律轉(zhuǎn)遷，不能到達峰端，圖3顯示了1例有代表性的分岔過程.調(diào)節(jié)IBTX的濃度從0～20μmol/L的變化過程中，損傷神經(jīng)自發(fā)放電從周期1放電變?yōu)殛嚢l(fā)經(jīng)過倍周期分岔到周期2、周期1周期2間新節(jié)律、012共存、整數(shù)倍，最后到達靜息，沒有發(fā)生激變.該結(jié)果顯示IBTX能引起放電節(jié)律的轉(zhuǎn)遷，說明在損傷區(qū)存在BK通道.但這種IBTX引起的節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程與TEA的作用效果相比較為簡單，只是部分再現(xiàn)TEA所誘發(fā)的轉(zhuǎn)遷歷程，最后到達靜息沒有經(jīng)過激變且無法洗回.

圖3 當IBTX從0到10μmol/L時，1例損傷神經(jīng)放電節(jié)律的變化Fig.3 The bifurcation scenario of an injured nerve fiber during application of IBTX （［IBTX］o increased from 0to 5μmol/L）

2.2.3 SK特異性阻斷劑Apamin使自發(fā)放電呈現(xiàn)部分節(jié)律轉(zhuǎn)遷 在Apamin的作用下，損傷神經(jīng)自發(fā)放電只呈現(xiàn)部分節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程，不能到達峰端，圖4顯示了一例有代表性的分岔過程.

如圖4，調(diào)節(jié)Apamin的濃度從0～100μmol/L的變化過程中，損傷神經(jīng)的自發(fā)放電從周期1簇放電經(jīng)過混沌到達周期2，出周期2經(jīng)過周期1周期2混沌進入周期1，最后經(jīng)過整數(shù)倍到靜息.

該結(jié)果說明在Apamin的作用下能引起放電節(jié)律的轉(zhuǎn)遷，說明在損傷區(qū)存在SK通道.但這種Apamin引起的節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程比較簡單，僅部分再現(xiàn)TEA所誘發(fā)的轉(zhuǎn)遷歷程.

2.2.4 聯(lián)合應(yīng)用IBTX和Apamin誘發(fā)的分岔轉(zhuǎn)遷歷程 聯(lián)合應(yīng)用IBTX和Apamin觀察損傷神經(jīng)起步點的節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程.如圖5，調(diào)節(jié)IBTX＋Apamin的濃度從0～6/25μmol/L的變化過程中，損傷神經(jīng)的自發(fā)放電從周期1簇放電開始經(jīng)過混沌逐漸向較高周期轉(zhuǎn)變，最后進入簇內(nèi)含有多個峰的放電（圖5b），但不能經(jīng)過激變到達峰端.該結(jié)果說明在兩種藥物共同作用下，放電節(jié)律的變化更豐富，轉(zhuǎn)遷程度高于單獨加藥，更接近TEA所誘發(fā)的節(jié)律轉(zhuǎn)遷歷程.進一步證明損傷神經(jīng)起步點存在BK、SK通道亞型.

3 討論

在正常的神經(jīng)軸突上，不存在大量裸露的離子通道，尤其是鉀離子通道和鈣離子通道［16］.我們之前的工作利用CCI模型，發(fā)現(xiàn)在慢性壓迫的損傷神經(jīng)上，可以產(chǎn)生持久并且節(jié)律豐富的自發(fā)傳入放電，本研究從功能上證明在損傷區(qū)可能存在鈣激活鉀通道，參與調(diào)節(jié)動作電位的時間序列模式.本文首先利用非特異性鈣激活鉀通道阻斷劑TEA作用于損傷區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TEA可以使放電經(jīng)歷從陣發(fā)或周期一再到高周期到簇內(nèi)有多個峰的放電經(jīng)過激變到達峰端的大分岔，提示在損傷區(qū)Kca可能起著關(guān)鍵的作用，再分別使用BK、SK特異性阻斷劑IBTX和Apamin，發(fā)現(xiàn)可使放電經(jīng)歷TEA所誘發(fā)的大分岔的一部分，既有頻率的變化又有節(jié)律的變化，表明BK、SK通道均可參與放電節(jié)律的調(diào)節(jié)，聯(lián)合應(yīng)用IBTX和Apamin，放電模式的分岔轉(zhuǎn)遷歷程和TEA所誘發(fā)的更為接近.上述實驗結(jié)果提示，在損傷神經(jīng)上可能存在BK、SK通道亞型.對損傷區(qū)含有BK、SK通道的進一步的證明可通過免疫組織化學(xué)等方法研究［17］，本文沒有涉及.

圖4 當Apamin從0到100μmol/L時，1例神經(jīng)放電節(jié)律的變化Fig.4 The bifurcation scenario of an injured nerve fiber during application of Apamin（［Apamin］0from 0to 100μmol/L）

圖5 當IBTX＋Apamin的濃度從0～6/25μmol/L時，1例神經(jīng)損傷區(qū)放電節(jié)律的變化Fig.5 The bifurcation scenario and firing trains of an injured nerve fiber during co-application of IBTX and Apamin（［IBTX＋Apamin］0from 0to 6/25μmol/L）

已有研究發(fā)現(xiàn)在損傷神經(jīng)的軸突上有多種離子通道的聚集，例如鈉通道、鉀通道，以及超極化激活的混合陽離子通道等［18－20］.我們的這一實驗結(jié)果提示在損傷神經(jīng)上有鈣激活鉀通道的聚集.雖然這些離子通道聚集產(chǎn)生的原因目前還不清楚，但可以猜測，當神經(jīng)發(fā)生損傷時，會啟動再生過程，細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)表達，包括各類離子通道，這些離子通道經(jīng)軸漿運輸運送到軸突.在正常情況下這些離子通道并不裝配在裸露的軸突膜上，但在損傷的神經(jīng)上，某種正常情況下控制通道蛋白上膜的機制被破壞，導(dǎo)致各種離子通道蛋白表達在損傷神經(jīng)軸突膜上.

以往對Kca的研究表明，在神經(jīng)元上BK主要參與IfAHP的形成，抑制了因胞內(nèi)Ca2＋濃度升高或膜去極化所引起的興奮和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放所引起的神經(jīng)元沖動的發(fā)放.研究表明，激活BK通道使DRG神經(jīng)元動作電位的時程縮短，動作電位的爆發(fā)頻率降低，用阻斷劑可使放電頻率增加［8］.SK通道調(diào)節(jié)ImAHP和IsAHP，主要是限制神經(jīng)元的放電頻率，產(chǎn)生放電頻率適應(yīng).邢俊玲等利用大鼠背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型，發(fā)現(xiàn)Apamin作用于損傷DRG可使放電頻率明顯增加［21］.本研究在神經(jīng)損傷區(qū)使用BK、SK通道特異性阻斷劑，不僅觀察了放電頻率的變化，而且重點觀察了放電節(jié)律的變化，證明在損傷神經(jīng)起步點存在BK、SK通道；分別應(yīng)用BK、SK通道特異性阻斷劑IBTX和Apamin，發(fā)現(xiàn)其誘發(fā)的分岔轉(zhuǎn)遷表現(xiàn)出細致的區(qū)別，即放電節(jié)律在apamin的作用下出現(xiàn)分岔轉(zhuǎn)遷后一般會自行恢復(fù)到加藥前狀態(tài)，而在IBTX的作用下一般不會出現(xiàn)自行恢復(fù)現(xiàn)象，提示BK、SK通道在調(diào)節(jié)放電節(jié)律中的作用不同.

4 結(jié)論

本研究在CCI模型大鼠坐骨神經(jīng)損傷區(qū)施加BK通道特異性阻斷劑IBTX和SK通道特異性阻斷劑Apamin，觀察到損傷神經(jīng)自發(fā)放電節(jié)律的轉(zhuǎn)遷，和TEA及降低胞外Ca2＋濃度所誘發(fā)的轉(zhuǎn)遷歷程相似但表現(xiàn)有細致的區(qū)別，只是部分的誘發(fā)了TEA所誘發(fā)的轉(zhuǎn)遷歷程.這些結(jié)果提示在損傷區(qū)存在鈣激活鉀通道，這些鈣激活鉀通道可能參與了損傷神經(jīng)自發(fā)放電的調(diào)控.這些發(fā)現(xiàn)有助于了解慢性神經(jīng)痛的外周機制，也為臨床上治療慢性神經(jīng)痛提供了新的思路.

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