張燕祥，張 錚，董 聲

（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

三 葉 木 通 （Akebiatrifoliata（Thunb.）Koidz.）為木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia Decne.）落葉木質(zhì)藤本植物，其根、莖、果實(shí)都可入藥，是我國傳統(tǒng)的中藥材，已被收錄于《中華人民共和國藥典》2010年版，其具有清熱利尿、活血通脈等功效，現(xiàn)代藥理研究表明其還具有抗腫瘤、抗衰老、降血壓等作用［1－3］.

目前對三葉木通的研究，主要集中在生物學(xué)特征、化學(xué)成分、藥用價(jià)值、育苗技術(shù)及病蟲害鑒定［4－6］的研究，而運(yùn)用分子標(biāo)記對三葉木通的研究中，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，與這兩種標(biāo)記技術(shù)相比，SRAP標(biāo)記具有信息量大，重復(fù)性好，操作簡單，費(fèi)用低等特點(diǎn)［7］，已被廣泛應(yīng)用于藥用植物、經(jīng)濟(jì)作物、農(nóng)作物等的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與克?。?－9］等的研究.我們期望建立和優(yōu)化適合于三葉木通的SRAP反應(yīng)體系，為三葉木通種質(zhì)資源評價(jià)、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源保存及遺傳育種等研究提供一種新的分子標(biāo)記方法.

1 材料與方法

1.1 材料

2012年4月在秦嶺地區(qū)選擇3個(gè)具有代表性的三葉木通居群，隨機(jī)選取健康植株共62株（表1），株間距大于50m，在每個(gè)植株上采集其幼嫩葉片20片，硅膠干燥，－20℃保存，用于室內(nèi)分析.

1.2 儀器與試劑

Taq酶（大連寶生物工程有限公司），DL2000 Marker（西安潤德生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)所用引物參照Li和Quiros［10］，由上海生工合成.

Microfuge 22R 離心機(jī)，PTC-200PCR儀（BIORAD公司），Tanon-1600數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）.

表1 三葉木通樣本的基本信息Tab.1 The basic information of Akebia trifoliate samples

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 三葉木通DNA提取采用本實(shí)驗(yàn)室確立的改良CTAB法［11］.1.5%瓊脂糖凝膠電泳及微量核酸蛋白分析儀檢測DNA質(zhì)量與濃度，－20℃保存.

1.3.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 擴(kuò)增程序參照Li和Quiros的程序［10］，設(shè)定為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，37℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存.三葉木通的SRAP的初始體系設(shè)定如下:（25μL）2.0mmol/L Mg2＋、1UTaq 酶、0.25 mmol/L dNTPs、30ng/25μL DNA、0.3μmol/L引物、1×Reaction Buffer.

以原初反應(yīng)體系作為標(biāo)準(zhǔn)，以M6E7為引物，對SRAP-PCR反應(yīng)體系中的影響因素 Mg2＋、dNTPs、Taq酶、引物、DNA 模板 的濃度 進(jìn) 行L16（45）的正交試驗(yàn)，各因素水平見表2.每個(gè)組合做兩個(gè)重復(fù)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果.

表2 SRAP反應(yīng)體系的因素水平設(shè)定Tab.2 The designation of factors and their levels in SRAP reaction

參照李仁偉［12］的直觀分析法，以擴(kuò)增條帶多、清晰、重復(fù)性好為原則來確定最適反應(yīng)體系.參照謝運(yùn)海等［13］的方法，根據(jù)同一引物，不同反應(yīng)組合中的SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，對條帶數(shù)、亮度、清晰度進(jìn)行打分統(tǒng)計(jì)，擴(kuò)增效果的總分為這3個(gè)指標(biāo)的和（即總分 ＝ 條帶分 ＋ 亮度分 ＋ 清晰分）；設(shè)置以上3個(gè)指標(biāo)的總分值為16分，在遺傳多樣性分析中，條帶的豐富度較重要，而亮度和清晰度次之，因此3個(gè)指標(biāo)各自的分值依次為10分、4分、2分.對條代數(shù)進(jìn)行打分時(shí)，條代數(shù)最多的打10分，以最多條帶為基準(zhǔn)，每減少一個(gè)條帶降低0.5分；對亮度打分時(shí)，選擇兩條主帶作為代表進(jìn)行打分.兩條都亮的為4分，一條亮而另一條亮度不足的為3分，兩條亮度都不足的為2分，一條亮度不足且缺一條主帶的為1分，無帶的記為0分；清晰度打分:分為2個(gè)等級，清晰度高的為2分，清晰度差的打1分.對16個(gè)組合中每個(gè)組合的兩個(gè)重復(fù)依次進(jìn)行評分，參照王騫春等［14］的極差分析方法，對實(shí)驗(yàn)中得到的分值進(jìn)行極差分析，各因素極差R為各因素最大平均值減去最小平均值，R越大說明該因素對指標(biāo)影響越大.

1.3.3 SRAP分析 利用SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，對由10個(gè)正向引物和10個(gè)反向引物隨機(jī)組合的100對引物進(jìn)行篩選，采用M-E的組合表示方式.用篩選出的引物分別對62個(gè)樣本進(jìn)行SRAPPCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖電泳，Tanon-1600數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)拍照.

將帶型編成二進(jìn)制數(shù)據(jù):1代表有帶，0代表無帶，利用軟件PopGene32計(jì)算基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、基因流、遺傳距離等.采用NTSYS-pc2.1軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

圖1 部分三葉木通材料提取DNA電泳圖Fig.1 The result of DNA electrophoresis from typical Akebia trifoliate

三葉木通部分樣本基因組DNA電泳結(jié)果見圖1.提取的樣本基因組DNA電泳條帶整齊、清晰、無拖尾，微量核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測其OD260/OD280值在1.8～2.0之間，能夠滿足SRAP反應(yīng)對DNA質(zhì)量的要求.

2.2SRAP-PCR體系的優(yōu)化結(jié)果

SRAP-PCR的正交試驗(yàn)結(jié)果如圖2，直觀分析表明，10號組合擴(kuò)增效果最好，條代數(shù)最多，條帶清晰且條帶亮度最高.對1到16個(gè)組合擴(kuò)增結(jié)果所得分?jǐn)?shù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3.各因素水平的變化對試驗(yàn)的影響程度由大到小依次為:Mg2＋、Taq酶、DNA、引物、dNTPs.

結(jié)合以上兩種評價(jià)方法，得出三葉木通SRAPPCR最佳體系為（25μL）:1×Reaction Buffer、Mg2＋2.5mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L、Taq 酶2U、引物0.4μmol/L、DNA 20ng/25μL.

圖2 正交試驗(yàn)PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果＊Fig.2 The amplification results of PCR reaction systems from orthogonal design

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal design

2.3 SRAP擴(kuò)增結(jié)果

利用SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，從100對隨機(jī)組合的SRAP引物中選出擴(kuò)增條帶豐富、清晰、重復(fù)性好的6對引物，分別對62個(gè)樣品進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，大部分條帶長度在100～2 000bp之間，形成了帶型豐富、片段大小不同的電泳圖譜.如表4所示，共檢測到142個(gè)清晰且可重復(fù)的條帶，其中多態(tài)性條帶共為124個(gè)，平均多態(tài)性比率為87.32%，表明SRAP分子標(biāo)記對三葉木通的基因組的SRAP-PCR擴(kuò)增效果較好，能夠提供豐富的信息位點(diǎn)，是進(jìn)行三葉木通遺傳多樣性的有效分析工具.3個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù)、遺傳距離及基因流計(jì)算結(jié)果，見表5、6.

表4 不同引物的擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 The amplification results from different primers and the genetic diversity parameters

表5 三葉木通居群的遺傳多樣性參數(shù)Tab.6 Genetic variation index of population of Akebia trifoliate

表6 三葉木通居群間的遺傳分化和基因流Tab.6 Analysis of differentiation between populations for Akebia trifoliate

2.4 聚類分析

聚類分析結(jié)果見圖3.從聚類圖中可以看出，在相似性系數(shù)為0.72（直線L2）處，可將62份三葉木通材料分為3大類群，第Ⅰ組群包含鎮(zhèn)安縣的所有樣本；第Ⅱ和第Ⅲ組群分別包含太白和佛坪的所有樣本.在相似性系數(shù)為0.666（L1）處，可將所有材料分為2大類群，第一類群包括第Ⅰ組群（鎮(zhèn)安居群），第二類群包括第Ⅱ組群（太白居群）和第Ⅲ組群（佛坪居群）.由遺傳差異分析表明，鎮(zhèn)安居群與太白居群的遺傳距離較大，基因流較??；太白居群與佛坪居群間的遺傳距離較小，基因流較大.不同居群間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與它們間的地理距離呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性.這可能是因?yàn)榈乩砭嚯x較近的兩個(gè)居群間存在的基因流降低了它們間的遺傳差異.

3 討論

SRAP是基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，受反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序變化及物種不同的影響.因此首先應(yīng)對其PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以確立穩(wěn)定性好的反應(yīng)體系.而優(yōu)化體系的方法一般有單因素、均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)3種，相對其他兩種設(shè)計(jì)，正交設(shè)計(jì)不僅試驗(yàn)次數(shù)較少而且能夠考慮到各因素間的交互作用，具有均衡分散、整齊可比及效率高等［15］特點(diǎn)，是相對較佳的一種方法.本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，得出三葉木通SRAP-PCR的最佳體系.各因素水平的變化對三葉木通SRAP-PCR反應(yīng)的影響程度依次為:Mg2＋＞Taq酶 ＞DNA＞引物＞dNTPs.在體系優(yōu)化的因素選擇上，與有些學(xué)者［16－17］一樣，選擇上述5個(gè)作為影響PCR的主要因素.但各因素水平變化對PCR反應(yīng)的影響程度不同，這與不同植物的基因組特性有關(guān).

本試驗(yàn)利用SRAP標(biāo)記對62份三葉木通進(jìn)行遺傳多樣性初步分析，平均每對引物擴(kuò)增出20.67條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率占87.32%，與本實(shí)驗(yàn)室前期利用AFLP標(biāo)記對三葉木通遺傳多樣性分析（待發(fā)表）相比，多態(tài)性高于AFLP標(biāo)記；從聚類結(jié)果看，分子聚類與樣品采集地的居群相一致，與本實(shí)驗(yàn)室前期的AFLP分子聚類的結(jié)果相同，而居群間的聚類SRAP標(biāo)記與AFLP的結(jié)果有略微差別.產(chǎn)生這種結(jié)果的原因首先是兩種分子標(biāo)記的原理不同，所揭示的基因序列不同；其次是所選的樣本量有所差異.SRAP標(biāo)記在62份三葉木通中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，而且重復(fù)性好，操作簡單，費(fèi)用低，在三葉木通遺傳多樣性的研究中是一種有效的分子標(biāo)記.

本研究顯示的三葉木通居群總的多態(tài)性比率為87.32%，而居群內(nèi)多樣性水平由高到低依次為佛坪居群、太白居群、鎮(zhèn)安居群.一般認(rèn)為，當(dāng)Nm＜1，遺傳漂變是種群間遺傳分化的主要原因，而Nm＞1時(shí)，基因流就可以防止由遺傳漂變引起的群體間的遺傳分化.從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，三葉木通在居群內(nèi)的遺傳多樣性水平不高，太白和佛坪居群間的基因交流頻率較高，可能是由于這兩個(gè)居群間的地理距離較近.居群間的遺傳變異的產(chǎn)生推測不是由遺傳漂變所致，可能主要是由于植物對生存環(huán)境的適應(yīng)而導(dǎo)致的遺傳分化.

對物種遺傳多樣性的研究是人類保護(hù)及合理利用資源的基礎(chǔ)，為了更合理利用及保護(hù)中藥資源，今后還需要更廣泛地采集樣本，把分子水平、形態(tài)學(xué)水平、有效成分分析以及生態(tài)環(huán)境等的研究結(jié)合起來，全面綜合評價(jià)、利用藥用植物資源.

圖3 基于SM的UPGMA聚類分析圖Fig.3 UPGMA dendrogram based on the genetic similarity

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選取對試驗(yàn)結(jié)果影響較大的 Mg2＋、dNTPs、Taq酶、引物及DNA共五個(gè)因素，并將每個(gè)因素設(shè)定四個(gè)水平.運(yùn)用L16（45）的正交試驗(yàn)，對三葉木通SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳反應(yīng)體系為（25μL）:1×Reaction Buffer、Mg2＋2.5 mmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、Taq酶2U、引物0.4 μmol/L、DNA 20ng/25μL.本次試驗(yàn)建立了一個(gè)較為完整可靠的三葉木通SRAP反應(yīng)體系，為今后研究三葉木通的遺傳多樣性以及優(yōu)異種質(zhì)選育等提供分子水平的參考，也為今后三葉木通屬SRAP標(biāo)記研究打下一定的基礎(chǔ).

應(yīng)用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系從隨機(jī)組合的100對SRAP引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性豐富的6對引物組合.用6對引物組合對62份三葉木通基因組DNA擴(kuò)增，共得到142條清晰可辨的條帶，平均每對引物擴(kuò)增出20.67條條帶，多態(tài)性比率為87.32%.由居群的基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)以及多態(tài)位點(diǎn)百分率都顯示鎮(zhèn)安居群（ZAY）內(nèi)的遺傳多樣性水平相對較低，最高的為佛坪居群（FP）.UPGMA聚類結(jié)果顯示，鎮(zhèn)安居群的供試材料間的遺傳變異不豐富，而太白居群與佛坪居群有著密切的親緣關(guān)系.

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